MALDI-TOF-MS在爱德华氏菌检测中的应用

，，，，

（厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026）

MALDI-TOF-MS在爱德华氏菌检测中的应用

龚艳清，郭书林，陈信忠，杨俊萍，叶妍妍

（厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026）

为建立快速检测和鉴定鱼类常见的爱德华氏菌的方法，采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法对来自淡水鱼的迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰爱德华氏菌（E. ictaluri）进行检测和鉴定。为测试该方法的重复性和稳定性，采用营养肉汤、BHI琼脂、DHL和TSA等4种不同培养基，以及用肉汤分别培养24 h、36 h、48 h和72 h的菌株进行检测，结果表明对该菌的蛋白质谱图影响很小；冷冻保存2年的菌株，用MALDI-TOF-MS进行检测，鉴定分值变化很小。对分离自不同水生动物的迟缓爱德华氏菌菌株进行检测，均可得到准确的结果。表明MALDI-TOF-MS技术可以快速、准确地检测和鉴定这两种爱德华氏菌。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）；迟缓爱德华氏菌；鮰爱德华氏菌；检测；鉴定

爱德华氏菌广泛分布于海水和淡水中，感染各种养殖水生动物，对水产养殖危害极大。对鳗鱼、鲶鱼、鳝鱼和其他多种动物致病，可造成严重经济损失[1-3]。引起鱼类发病的病原菌主要为迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌。现已知迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是多种淡、海水养殖鱼类的重要病原菌，引起鱼类肾脏、肝脏脓疡病灶的疾病，损失严重，是目前水产养殖中危害较大的病原菌[3]。该菌适应性强，能适应多种不同宿主的体内环境，除了鱼类，该菌还可感染两栖类、爬行类和哺乳类，也是爱德华氏菌属中唯一能够感染人类的种类，成为一种人畜共患病的病原菌；鮰爱德华氏菌（E. ictaluri）也可使鱼类发病，但危害性比迟缓爱德华氏菌小，目前已报道的主要导致斑点叉尾鮰肠败血症，可以危害所有规格的斑点叉尾鮰，但主要影响苗种存活率，已成为美国养殖斑点叉尾鮰最主要的疾病之一。

传统的细菌鉴定方法依据细菌的形态学和生理生化特性分析，不仅耗时长，而且由于生化特性容易受培养基、保存时间等因素的影响，常常给鉴定带来困难。近年来快速发展的基因检测技术在微生物鉴定方面取得了一定的应用，但由于其敏感性高，容易出现假阳性，而且对近似种的细菌鉴定还存在一些不足。因此，对一些与人和动物关系密切的病原菌还需要建立更加快速、准确、实用的检测和鉴定方法。本研究应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术建立了检测和鉴定两种常见爱德华氏菌的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

本实验所用的迟缓爱德华氏菌（编号1101）和鮰爱德华氏菌（编号HSA-1）菌株购自武汉水生生物研究所，两株菌株经生化及分子生物学方法确认。

1.1.2 细菌培养基和生化鉴定卡

营养肉汤、BHI琼脂、DHL琼脂和TSA琼脂等细菌培养基由北京陆桥技术有限公司提供；生化鉴定GN卡由法国生物梅利埃公司提供。

1.2 仪器与设备

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI Biotyper），德国布鲁克公司；全自动微生物鉴定仪VITEK 2（compact 30），法国生物梅利埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的复活与检测

用营养肉汤对细菌进行复活后接种于BHI和DHL培养36 h，进行MALDI-TOF-MS检测。

1.3.1.1 样品处理

挑取可疑单个菌落于1.5 mL的离心管中，用生理盐水10000 r/min离心2min洗涤二次；用75%的酒精固定细菌的表面蛋白；用等量的 70%甲酸和乙腈溶解表面蛋白，10000 r/min离心2 min。

1.3.1.2 点靶

吸取1.3.2.1中的上清点靶。先点1 µL上清于样品靶板上，同时点1 µL标准品溶液（校准靶板），待液体干后立即点1 µL基质溶剂。

1.3.1.3 质谱图的采集和分析

应用MALDI Biotyper仪器，选择BioTyper par的采集方法对细菌的图谱进行采集。用标准品对仪器进行校准后，采集样品质谱图。应用BioTyper软件对细菌质谱图进行分析和鉴定。

1.3.2 重复性实验

两种爱德华氏菌分别接种10份营养肉汤，30℃培养24～36 h后按上述方法进行MALDI-TOFMS检测，比较该方法得到的质谱图和检测结果的重复性。

1.3.3 培养基对MALDI-TOF-MS检测的影响

分别采用肉汤、BHI、DHL和TSA琼脂培养基，37℃培养36h后进行MALDI-TOF-MS检测和鉴定，比较培养时间对细菌蛋白质谱图的影响。

1.3.4 培养时间对MALDI-TOF-MS检测的影响

用营养肉汤37℃培养，分别在24 h、36 h、48 h和72 h对菌株进行MALDI-TOF-MS检测和鉴定，比较培养时间对细菌蛋白质谱图的影响。

1.3.5 保存时间对MALDI-TOF-MS检测的影响

对保存2年的菌株复活后采集质谱图，与菌株‐70℃保存前的质谱图进行对比，比较细菌保存时间对质谱图的影响。

1.3.6 全自动微生物鉴定仪（VITEK）法

按照仪器的操作要求，将1.3.1中培养的单个特征性菌落种于含3.5%盐的营养琼脂斜面，37℃培养24～36 h。用灭菌棉签取适量细菌用稀释液稀释至特定浓度，用VITEK 2 GN鉴定卡进行鉴定，并与菌株保存前的生化指标进行比对，比较其生化反应的稳定性。

1.3.7 不同来源的迟缓爱德华氏菌的MALDITOF-MS鉴定

将冷冻保存的从罗非鱼、鳗鱼、大菱鲆、鲤鱼、牛蛙及甲鱼等水生动物中分离，并经形态和生化鉴定为迟缓爱德华氏菌的20株菌株用肉汤培养液复活，进行MALDI-TOF-MS鉴定，并与菌株保存前的生化鉴定结果进行比较，判断MALDI-TOF-MS检测结果的准确性。

2 结果与分析

2.1 MALDI-TOF-MS检测结果

2.1.1 MALDI Biotyper的判断标准和鉴定结果

判断标准是待检细菌与数据库中标准菌株质谱图的符合度，用得分表示，得分愈高，说明待测菌株的谱图同质谱库中某一标准菌株的谱图（质量和峰高）愈相近。分值在2.300～3.000之间，标记为（+++），可完全确认菌株鉴定结果；分值在2.000～2.299之间，标记为（++），可基本确认菌株鉴定结果；分值在1.700～1.999之间，标记为（+），该菌株鉴定为不确定结果；分值在0.000～1.699之间，标记为（-），可判断不是该种细菌。

上述两种爱德华氏菌经Biotyper数据库鉴定后，与数据库中相应的爱德华氏菌的匹配分值分别为：迟缓爱德华氏菌为2.495、鮰爱德华氏菌2.367，且两种爱德华氏菌的质谱图比较相似，即其具有相近的蛋白组成，以此可以与其它非爱德华氏菌进行区分。图1为两种爱德华氏菌在分子量5000～8500间的质谱图，从图中可以看出，两种爱德华氏菌之间的质谱峰存在明显的差异，可以进行爱德华氏菌的种间鉴别。表1为两种爱德华氏菌在分子量5000～8500之 间 的峰值比较，从表中可以看出鮰爱德华氏 菌 在5000～8500区间有20个可读峰值，而迟缓爱德华氏菌只有16个，缺少5384、7273、7983、8382左右的峰值。而且两种细菌的重复性试验结果表明，其质谱图变化很小，表现出很好的重复性，迟缓爱德华氏菌与数据库中Edwardsiella tarda ATCC 36.1 EGS的匹配分值均在2.45～2.495之间，与Edwardsiella tarda HL 23.1 EGS 的匹配分值均在2.35～2.392之间，与Edwardsiella tarda ATCC 35.1 EGS 的匹配分值均在2.302～2.31之间；鮰爱德华氏菌与数据库中Edwardsiella ictaluri 885 EGS的匹配分值均在2.35～2.367之间，与Edwardsiella ictaluri DSM 13697 HAM的匹配分值均在2.046～2.1之间，说明MALDI-TOF-MS技术具有良好的重复性。

2.1.2 培养基对爱德华氏菌质谱检测结果的影响

采用营养肉汤、BHI琼脂、DHL琼脂和TSA琼脂等4种不同的培养基对爱德华氏菌进行MALDI-TOF-MS检测，结果见表2，表明4种培养基培养的细菌均能得到良好的匹配分值，比较其蛋白质谱图没有明显的差异。说明这些细菌在不同的培养基中培养，得到的MALDI-TOF-MS蛋白质谱图基本不变，具有良好的稳定性。

2.1.3 培养时间对爱德华氏菌质谱检测结果的影响

图1两种爱德华氏菌MALDI-TOF-MS图谱

表1两种爱德华氏菌在分子量5000～8500间的蛋白组成比较

表2爱德华氏菌在不同培养基中培养的质谱检测结果

取培养约24 h、36 h、48 h和72 h 4个不同时间段的爱德华氏菌进行MALDI-TOF-MS检测，结果见表3，表明不同生长阶段的细菌用MALDITOF-MS检测得到的蛋白质谱图基本保持不变，与数据库中相应参考菌株的匹配分值均在2.3以上，而且至少72 h内，其蛋白质谱图没有明显的变化，不影响MALDI-TOF-MS检测结果。说明这些细菌在不同生长阶段得到的MALDI-TOF-MS蛋白质谱图具有良好的稳定性。

表3不同培养时间爱德华氏菌质谱检测结果

2.1.4 细菌冷冻保存对MALDI-TOF-MS检测的影响

保存两年的菌株复活后的质谱图与保存前的质谱图基本没有差异，结果见图2和图3。鉴定分值迟缓爱德华氏菌分别为 2.491和 2.496；鮰爱德华氏菌分别为2.364和2.356。说明该方法具有很好的稳定性。

2.2 生化鉴定结果

VITEK 2 GNTest Kit鉴定卡可以对革兰氏阴性菌的48项生化指标进行鉴定，两株细菌的大部分生化结果一致，只在D-甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐、H2S等生化反应上有差异，上述2株爱德华氏菌经全自动微生物鉴定仪鉴定后，均能区分开来，符合率在95-99%之间。冷冻保存两年后的菌株的生化与保存前的生化会有差异，符合率也低于90%，如：鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶保存前为阳性，保存后变为阴性，脂酶由阴性变为可疑等，说明用传统的生化反应来鉴定细菌存在一定的缺陷。

2.3 不同来源迟缓爱德华氏菌的MALDI-TOF-MS鉴定结果

对复活的20个迟缓爱德华氏菌的菌株进行MALDI-TOF-MS鉴定，其质谱图变化很小，与数据库中迟缓爱德华氏菌的匹配分值都均在2.35以上，可信度很高。说明MALDI-TOF-MS技术具有很好的准确性。而VITEK对20株迟缓爱德华氏菌的鉴定值有5株只有85%，在结果判断上可信度有所降低。

3 讨论

目前针对爱德华氏菌的鉴定方法报道的有分子生物学方法、酶联免疫法及传统的分离培养生化鉴定法[4-14]，尚无应用MALDI-TOF-MS方法鉴定爱德华氏菌的报道，本文通过对水生动物致病的两种常见爱德华氏菌分别应用MALDI-TOF-MS技术及传统生化鉴定方法进行检测，结果表明MALDI-TOF-MS在检测时间、重复性、稳定性、准确性等方面的总体表现均优于传统生化鉴定方法。而且不同细菌培养基培养的菌株、不同生长阶段的细菌以及冷冻保存两年后的菌株均可以用于MALDI-TOFMS检测，得到准确的鉴定结果。

图2保存时间对迟缓爱德华氏菌MALDI-TOF-MS图谱的影响

图3保存时间对鮰爱德华氏菌MALDI-TOF-MS图谱的影响

MALDI-TOF-MS技术以细菌表面蛋白为检测对象，通过量化分析每种细菌的表面蛋白组成，与标准参考菌株的MALDI-TOF-MS图谱进行比较，从而得出鉴定结果。由于每种生物的蛋白组成经过长期的进化，具有很好的稳定性。细菌的蛋白组成也主要取决于遗传因素，受培养基、培养时间以及其它培养条件等外部因素的影响很小。因此，与其他技术相比，MALDI-TOF-MS具有很好的稳定性和重复性。

[1] 董丽，王印庚，张正，等.养殖大菱鲆细菌性红体病病原菌的分离与鉴定[J] .海洋科学，2009，33（7）：57-63．

[2] 王印庚，秦蕾，张正，等.养殖大菱鲆的爱德华氏菌病[J].水产学报，2007，31（4）：487-495．

[3] 秦蕾，王印庚，张晓君.迟钝爱德华氏菌感染大菱鲆的病理学研究[J].中国水产科学，2009，16（3）：411-4l9.

[4] 李晨，王秀华，黄倢.3种主要水产病原菌多重PCR检测方法的建立[J]..渔业科学进展，2010，31（3）：100-107.

[5] 邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.多重聚合酶链反应快速检测嗜水气单胞菌和爱德华菌[J].中国人兽共患病杂志， 2008，24（8）：752-754.

[6] 邓显文，谢芝勋，刘加波，等.罗非鱼迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定[J].水生态学杂志，2009，2（1）：114-117．

[7] 邓显文，谢芝勋，刘加波，等.广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定[J].广西农业科学，2008，39（2）：231-235．

[8] 梁万文，陈明，余晓丽，等.斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立[J].大连水产学院学报，2007，22（4）：264-269.

[9] 贾俊涛，曹际娟，陈吉祥，等.大菱鲆迟钝爱德华氏菌病病原菌的分子生物学鉴定及系统发育学分析[J].中国渔业质量与标准，2012，2（1）：41-46.

[10] 邓显文，谢芝勋，谢丽基，等.二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病[J].水生态学杂志，2009，30（2）：158-160.

[11] 邓先余，罗文，谭树华，等.黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）“红头病”病原菌迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）的分离及鉴定[J].海洋与湖沼，2008，39（5）：511-516.

[12] 徐进，罗晓松，曾令兵.黄颡鱼鲇爱德华氏菌的分离鉴定及其致病性研究[J].淡水渔业， 2009，39（6）：47-52.

[13] 陈福艳，陈明，黄婷，等.六须鲶暴发性败血症病原菌的分离与鉴定[J].大连水产学院学报， 2011，26（1）：63-67.

[14] 李重实，李强，刘海燕，等. 鲶爱德华氏菌间接酶联免疫快速检测法的建立[J].广东海洋大学学报， 2010， 30（4）：17-21.

Detection and Identifcation of Edwardsiella sp. by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

Gong Yanqing，Guo Shulin，Chen Xinzhong，Yang Junping，Ye Yanyan
（Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026）

Matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）was experimentally used to test and identify the reference strains Edwardsiella tarda and E. ictaluri isolated from freshwater fsh to establish a rapid method for detection and identifcation of Edwardsiella sp. In order to verify its stability and repeatability，the bacteria cultured in different medium such as nutrient broth，BHI agar，DHL and TSA，and in different time intervals of 24，36，48 or 72 h were tested with the mass spectrometry and little impacts were found. There were no changes of the identifcation scores of the bacteria preserved for two years using MALDI- TOF-MS. The strains of E. tarda isolated from different aquatic animals could also be exactly identifed by the method. It was shown that the MALDITOF-MS technique could be used to detect the two Edwardsiella sp. quickly and accurately.

matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF- MS）；Edwardsiella tarda；Edwardsiella ictaluri；detection；identifcation

R446.5；S941.42

：A

：1005-944X（2014）06-0089-05

国家质量监督检验检疫总局公益项目（201210055）；国家质检总局科研项目（2013IK045）

陈信忠