应用随机引物法鉴定伪劣羊肉卷中的肉种成分

王 昱，叶自霞，聂福平，肖进文，杨 俊，袁增壮，王国民，李应国，李正国

（1.重庆大学，重庆 400044；2.重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；3.西南大学，重庆 400716）

应用随机引物法鉴定伪劣羊肉卷中的肉种成分

王 昱1，2，叶自霞3，聂福平1，肖进文1，杨 俊1，袁增壮3，王国民1，李应国1，李正国1

（1.重庆大学，重庆 400044；2.重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；3.西南大学，重庆 400716）

为鉴定市场抽检的来源不明的伪劣“羊肉卷”中的肉种成分，采用随机引物法，PCR扩增肉制品DNA，将阳性产物回收、克隆并测序，然后根据序列信息设计特异性的荧光定量引物进行再次鉴定。结果表明，获得了针对伪劣“羊肉卷”的阳性克隆，序列比对表明样品中含有北极狐或火狐肉成分，经特异性的荧光定量PCR确认样品为火狐肉。结果表明，可以应用随机引物PCR鉴定伪劣“羊肉卷”中的肉种成分。

随机引物法；肉制品；物种成分；鉴定

近来一些不法商贩为谋取暴利，常以禽肉冒充猪肉，以猪肉冒充牛、羊肉等手段掺杂掺假[1]，扰乱市场秩序，损害消费者的健康和利益，并且违背了部分人的宗教信仰[2]。公安部于2013年2月公布了10起打击食品安全犯罪典型案例[3]，其中有5起与肉制品的制假有关。目前，常规的方法主要是通过肉制品的味道、色泽、纹理等辨别肉类来源，但肉制品经过加工后失去了原有的质地和特征，增加了肉品来源鉴定的难度[4]。在近日的工商委托检测中，我们发现采用现有的检测标准，如SN/ T2051-2008、GB/T 25165-2010等，所得结果均为阴性，样品来源不明。为此，亟待一种针对未知来源样品的广谱的肉种鉴定方法。

现有的肉种来源鉴定方法主要利用特异性的引物和（或）探针进行PCR，得以鉴定。孙艳华[5]等人用PCR法检测熟肉制品中肉类来源，结果表明，建立PCR法仅需20 mg的样品，检出限为2×10-6g。沙才华[6]等人用三重PCR鉴别肉制品中猪和牛源性成分，结果可同时检测牛猪成分的含量为0.1ng/μL，并在6份样品中检测出1份掺假制品。吴登俊[7]运用PCR-RFLP技术鉴别混合牛肉及制品的来源，结果发现24个品牌的牦牛肉干制品中仅有3个品牌是牦牛肉，有6个品牌是黄牛肉制品，还有4个品牌是水牛肉制品。侯东军[8]

等用LAMP法鉴定牛羊肉中的掺杂肉，结果可检出牛肉中0.01%～2%的猪肉成分。赵冉[9]建立双重荧光PCR法检测动物产品中猪源性和牛源性成分，结果牛肉和猪肉的检测限均为10-5，与相应的单重荧光PCR的检出限一致。特异性引物探针可以快速地鉴定肉种来源，但是却只能鉴定引物探针预设好的已知肉类。由于肉制品的掺假现象的复杂性，被掺杂的常常是不为人知的肉类，如果仅仅有常用的猪牛羊马等引物探针去检测，不仅会出现漏检现象，也常出现无法检出的现象。

随机引物PCR是以PCR为基础，使用随机寡核苷酸链作引物，对目的基因进行PCR扩增[10]。目前，随机引物PCR多用于RAPD标记分型[11-12]、动植物细菌[13]、病毒[14]的鉴定以及寄生虫[15]的分型。Yuri Y[13]等人用随机引物对肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、炭疽杆菌以及鼠疫耶尔氏菌等有机体进行了鉴定。Amy L Clem[16]等用3端随机引物对人类血浆病毒有无腺病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞体病毒进行了鉴定，检出限为1000 PFU/mL。Farooq U[17]等用随机引物法区分了不同株的恶性疟原虫可引起不同程度的疟疾。目前，国内外还没有关于运用随机引物PCR技术对肉制品来源鉴定的报道。本文拟借鉴用于未知微生物鉴定的随机引物PCR，对未知肉样DNA进行随机扩增，然后将扩增产物进行克隆测序，加以鉴定。

1 材料及方法

1.1 材料

待鉴定的肉样一共两份，均为某市公安局2013年度的打假行动中抽取的样品，具体来源不明。两袋样品均为10kg/袋包装，打开后呈现片状外观，状态良好，无腐败现象。样本置-20℃冰箱低温保存。

1.2 引物

研究用引物见表1，均由大连宝生物公司合成。

1.3 主要试剂

营养肉汤，购自北京路桥技术有限公司；深加工食品DNA提取试剂盒，购自北京TIANGEN公司；Taq DNA Polymerase和dNTP购自北京Promega公司；QIAAquick Gel Extration kit，购自德国QIAGEN公司；pMD-19T载体试剂盒和SYBR® Premix Ex Taq™ （Tli RNaseH Plus） （RR420A），购自大连宝生物公司。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理及核酸提取。将未知来源的肉制品随机挑选不同部位，做成不同小样，然后分别剪碎，用PBS溶液（含5%吐温20）振荡洗去表明添加的佐料及油脂，经液氮冷冻后，用研钵碾碎成粉末状，备用。使用深加工食品DNA提取试剂盒提取DNA，过程如下：称取样品100mg，加入500μL的GMO1和20μL的Proteinase K（20 mg/mL），涡旋振荡1min；56℃孵育1～12h，至裂解完全；加200μL的GMO2，混匀，涡旋振荡1min，静置10min；12000 r/min离心5 min，将上清液转移至新的离心管中；加入0.7倍的异丙醇，混匀，12000 r/min离心3min，弃上清；加700μL 70%的乙醇，震荡5s，12000r/min离心2min，弃上清，重复此步骤；开盖倒置5～10min，晾干残余的乙醇；加入20～30μL洗脱缓冲液TE，涡旋震荡1min，即获得DNA模板。

1.4.2 PCR扩增、回收及克隆。按如下要求配置100μL体系的反应液：10μL 10×PCR缓冲液；2μL的10mmol/L dNTP Mix，终浓度为0.2 mmol/L；6μL的25 mmol/L MgCl2，终浓度为1.5 mmol/L；2μL的5U/μL Taq聚合酶，终浓度为0.1 U/μL；9μL的25μmol/L随机引物，终浓度为2.25μmol/

L；66μL的灭菌水；5μL的DNA模板。按如下条件进行DOP PCR扩增：第一阶段，95℃预变性5min，共1个循环。第二阶段，94℃变性1min；30℃退火1min30s；72℃延伸3min（将增温速率设置为5%，即0.2℃/s），共5个循环。第三阶段，94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min（从第2个循环开始每个循环增加14s），共35个循环。产物用QIAAquick Gel Extration kit进行胶回收，方法同试剂盒说明书。回收的DNA片段用pMD-19T载体试剂盒进行目的基因的连接及克隆：在PCR管中依次加入5.0 μL的solution I，0.5μL的vector 以及4.5μL的DNA模板，在16℃条件下反应3～12 h。然后转化DH5α感受态，蓝白斑筛选阳性克隆。

表1研究用引物列表

1.4.3 插入子的鉴定。从平板上挑取单菌落（白斑），在营养肉汤中培养过夜。按如下要求配置25μL体系的反应液：2.5μL的 10×PCR缓冲液；0.5μL的10 mmol/L dNTP Mix，终浓度为0.2 mmol/L；1.5μL的25 mmol/L MgCl2，终浓度为1.5 mmol/L；0.5μL的5U/μL Taq聚合酶，终浓度为0.1 U/μL；各1μL的10μmol/L上下游引物（M13 primer），终浓度为0.4 mol/L；18 μL的灭菌水；1μL 的菌液。按如下条件进行PCR扩增：95℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。然后，取5μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压110V，电流400mA，时间30 min。根据产物长度判断是否为插入了外源片段的阳性克隆子。

1.4.4 测序和分析。将克隆的阳性质粒进行序列测定，测序过程交大连宝生物公司完成。将测定的序列去除载体序列，然后使用BLASTn进行序列比对，比对参数默认。分析插入序列的同源序列，并和相关序列进行进化树的绘制，绘制方法采用近邻法。

1.4.5 荧光PCR再鉴定。为了鉴定未知肉制品是否为火狐或北极狐中的其中一种，针对火狐线粒体基因（NC_008434.1）和北极狐的ATP合成酶基因（AH014073.1）分别设计一对特异性引物（表1）。采用添加SYBR GREEN 染料法进行再检测。20 μL检测反应体系包括：0.25 umol/L 上/下游引物，5μL DNA 模板 以及 10 μL 2×SYBR® Premix Ex Taq预混剂。循环条件：95℃ 30s；95℃5s，60℃ 20s，40个循环。同时，从山东某养殖场购买火狐、白狐肉，提取核酸后作为阳性对照。检测结果以Ct值大小和扩增曲线综合判定。

2 结果

2.1 随机PCR及克隆制备

相同DNA样本的不同随机PCR产物在2%的琼脂糖胶上均呈弥散条带（图1），其中DOP-PCR的产物在100到200之间有一浓度很大的集中扩增产物，而另两个随机PCR的产物整体浓度偏低，没有集中的扩增产物或扩增条带。故选取DOP-PCR产物的集中扩增区，进行切胶回收。如图2所示，胶回收的产物连接到pMD19T载体上后，克隆子经M13引物鉴定后，有外源插入的克隆子长度大于130bp（泳道3），而没有外源片段插入的克隆子产物长度为130bp（泳道1、2、4、5、6）。阳性质粒和阴性质粒的长度在琼脂糖电泳上略为有差异，阳性质粒略长于阴性质粒。结果表明，DOP引物的PCR扩增比另外两个引物要好。扩增产物经过克隆后，获得了包含插入序列的阳性克隆（图3）。

图1随机PCR扩增产物电泳

图2.克隆子的插入鉴定

图3阳性质粒和阴性克隆子

图4阳性克隆的序列信息及Blast结果

2.2 序列分析

阳性克隆的序列如图4所示，经Blast分析后，克隆子的序列和北极狐（Alopex lagopus）和赤狐（Vulpes vulpes）的微卫星序列相似度分别高达92%和93%。然后，以牛的微卫星序列为对照，包括了犬微型序列的系统发育树也表明，克隆子形成两个差异度极小的分支，与赤狐、北极狐聚类成一支（图5）。据此，推测该肉制品的可能来源为狐属动物。

2.3 荧光定量PCR检测

如图6所示，赤狐体基因的特异性引物能特异性扩增未知肉制品DNA，扩增曲线呈典型的S型，Ct值为24.1。然而，针对北极狐ATP合成酶基因的引物未能扩增，Ct值大于总循环数（40），且没有特征性扩增曲线。同时，针对赤狐肉（Ct值15.2）和白狐肉（Ct值为17.1）的对照扩增正常。结合序列测定结果，可以认定该未知来源的肉制品为赤狐肉。

3 讨论

由于市场的混乱和信用体系的缺失，我国的肉制品的掺假现象愈演愈烈[1]。如何对各种市售肉制品的来源进行肉种成分鉴定，已经成为维护正常流通秩序、保证消费安全的难题。

图5阳性克隆子的发育进化树

图6荧光定量PCR鉴别检测未知来源“羊肉卷”成分

本研究中，我们首先对送检的肉制品采用食品行业标准规定的检测试剂盒和检测方法进行了鸡、马、牛、羊、兔、猪以及驴源成分的PCR检测，均未见特异性的扩增。在排除了DNA模板和PCR反应体系的问题后，初步认为该未知来源肉制品并非鸡、马、牛、羊、兔、猪和驴中的任何一种。为此，我们采用了文献报道的随机引物法对样品DNA进行扩增。对集中的扩增产物进行克隆测序，获得了样品的大致基因信息。GACCATCTAGCGACCTCCACMNNMNM引物[18]和VVVVVVVVAA引物[16]均没有获得文献报告的扩增效果，条带极弱。而引物CCGACTCGAGINNNNNNATGTGG[19]的扩增结果较为理想，在200 bp左右得到了集中的扩增产物，由此，通过TA克隆实现了样品基因序列的获取。阳性克隆子的序列经比对分析表明为火狐或北极狐的微卫星基因序列。由于两个物种的微卫星序列有着相当高的同源性，故需采用别的基因来验证未知肉制品是否为其中的一种。荧光定量PCR没有针对阳性克隆子的序列本身进行引物设计，而是针对火狐及北极狐的线粒体及ATP合成酶基因设计引物，是为了从另一个侧面来鉴定样品的真正来源。定量PCR的检测结果从另一个侧面证实了克隆子的来源是火狐而非北极狐。

采用随机引物法进行PCR鉴定未知来源的肉制品物种成分，虽然可以实现广谱检测，理论上不会漏掉掺入的任何一种成分，但是将该方法应用于标准化检测尚有一定的距离。主要的问题在于，操作步骤较为繁琐，不同的试验条件下得到的结果较难标准化。而且由于不知道待鉴定的肉样是何物种，无法在随机引物PCR扩增以及后续的荧光定量检测中设定阳性检测对照，检测过程类似一个“黑匣子”。试验中我们也发现，由于随机引物PCR的产物较为复杂，呈现弥散的状态，对回收和克隆的要求极高。由于回收的产物浓度低，长短不一，即便获得了大量的阳性克隆子，也会出现相似序列不止一到两种的情况，因此也需要结合常规方法进行再次确认。本文成功采取另选基因（线粒体基因和ATP合成酶基因）设计荧光定量引物的方法，对序列比对的结果进行再鉴定。由此可见，随机引物PCR法可望用于未知来源肉制品的肉种成分鉴定。

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Application of Random Primer Method for the Identif cation of Species Composition in Fake “Sliced Mutton”

Wang Yu1，2，Ye Zixia3，Nie Fuping1，2，Xiao Jinwen2，Yang Jun2，Yuan Zenzhuang3，Wang Guoming2，Li Yingguo2，Li Zhengguo1

（1. Chongqing University，Chongqing 400044；2.Chongqin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020；3. College of Animal Science and Technology，Southwest China University，Chongqing 400715）

To identify species composition of meat and meat products sampled from market，random primer method was used for PCR amplif cation of meat DNA，the positive products were recovered，cloned and sequenced，and then the specif c real time PCR primers were designed according to the sequence information for re-identif cation. Positive clones were obtained from the sliced mutton，and sequence alignment indicated that the sliced mutton sample contained Alopex lagopus or Vulpes vulpes meat ingredients. The Vulpes vulpes meat ingredient was conf rmed in the sliced mutton sample by specif c quantitative PCR. The results showed that the random primer PCR could be applied to the identif cation of species origin of meat and meat products .

random primer method；meat product；species composition；identif cation

TS251.7

：A

：1005-944X（2014）10-0074-06