PAX3基因对神经嵴发育的调控及其在Waardenburg综合征发病中的作用研究*

张华 综述 冯永 审校

Waardenburg综合征(Waardenburg Syndrome，WS)是最常见的综合征型聋，又称听力-色素综合征，主要遗传方式为单基因致病的染色体显性遗传伴不全外显。其病因主要是由于神经嵴(neural crest，NC)发育异常而导致其分化的黑素细胞发育障碍所致[1]，PAX3(Pair Box 3，配对盒基因3)是NC生长发育的关键调控基因之一。WS人群发病率为1/42 000，占先天性聋的2%～5%，聋哑人群中其发病率为0.9%～2.8%[2]。该综合征主要临床特征为感音神经性聋及虹膜、头发和皮肤的色素分布异常。WS具有高度的临床和遗传异质性，依据不同的伴随表型将其分为4型(WS1-4)[3]，其中以WS1和WS2最多见。已证实有6种基因与WS有关[3]，PAX3是其主要的致病基因之一，其突变可导致WS1和WS3。本文就PAX3基因在WS发病机制中的作用研究进展予以综述。

1PAX3基因简述

1.1PAX3基因结构与分布表达 PAX3基因定位于2q35-2q37，包含10个外显子，cDNA全长1.4 kb，其编码的PAX3蛋白是配对盒转录因子PAX家族成员之一。人和小鼠PAX蛋白家族共有九个成员，PAX3蛋白在脊椎动物高度保守，人和小鼠的PAX3蛋白氨基酸序列高度保守，同源性达98%[3]。PAX3在人和小鼠神经、心血管、内分泌和骨骼肌系统的正常形成和发育中起关键作用[4，5]。PAX3在小鼠胚胎期第8.5天(E8.5)时开始表达，在第9～12天(E9～E12)达高峰，第13天(E13)时开始下降，到第17天(E17)表达最低。PAX3最早于NC迁徙前在背神经管表达，后随神经管的迁徙发育而逐渐开始在中枢神经系统、关节、骨骼肌以及NC源性组织如周围神经系统(感觉和运动神经节、脊神经后根、交感神经节、胃肠道神经节)、心肌间质、平滑肌、胸腺、肾上腺髓质细胞、皮肤毛发和内耳的黑素细胞中广泛表达，调控胚胎的生长发育，在骨骼肌、肿瘤及黑色素的形成过程中发挥重要作用。

1.2PAX3基因蛋白结构与功能域 PAX3蛋白由479个氨基酸组成，分子量约53 kD，主要特征是含有4个高度保守的结构域[4]：配对盒结构域(paired box domain，PD)、同源结构域(homeodomain，HD)、高度保守的锌肽序列和富含丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸的转录激活域，其中PD和HD是PAX3蛋白的重要功能域，具有高度的保守性，主要作用是与特异DNA结合。GTTCC或GTTAC及ATTA分别是PD和HD结合DNA的核心序列[6]。

PD在PAX3的氨基末端区，由第34～161位共128个氨基酸组成，包括2～4号外显子，含有2个亚结构域PAI和RED，分别位于PD的N端和C端。每个PAI域和RED域各有一个螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)结构，每个HTH序列均由3个α-螺旋组成[4]。PAI的作用是结合DNA以及促进PAX3与其他蛋白的相互作用，RED亚区在PAX3蛋白中的作用还不是很清楚。体外实验[7，8]显示PD促进PAX3与DNA结合以及与其他蛋白相互作用，如与含有高迁移组功能域(high mobility group，HMG)的SOX10蛋白[SRY (sex determining region Y)-box 10，性别区决定盒10]和CIB1蛋白(calcium and integrin binding 1, 钙粘和蛋白1)相互作用。通过PD域，PAX3与SOX10可协同激活在黑素细胞中起重要调控作用的MITF基因(microphthalmia-associtated transcription factor，小眼畸形相关转录因子)和c-RET基因(cret receptor tyrosine kinase，酪氨酸蛋白激酶受体)转录。HD是PAX3蛋白与DNA结合以及与其他蛋白相互作用的另一个功能域，由第220～277位共58个氨基酸组成，包括5、6号外显子，包含3个α-螺旋结构：螺旋Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。同PD一样，HD可与其它蛋白作用以调控PAX3活性[4]，也可调节PD与DNA的结合[9]。二者在功能上并非相互独立，而是可以相互作用促进PAX3蛋白与DNA结合。PD的突变可以影响HD与DNA的结合，HD的突变也可以影响PD与DNA的结合[10]。

2 PAX3基因突变与WS1/WS3

1992年Tassabegji和Baldwin首次在WS1患者检测到PAX3基因杂合突变，使得PAX3成为WS的第一个致病基因，揭开了从分子水平研究WS发病机制的序幕。1993年Hoth在WS3患者中检测到PAX3基因杂合突变[11]，同年PAX3突变小鼠模型Sploth(Spl)小鼠建立[12]，纯合突变Pax3小鼠Spl(-/-)由于神经管发育缺陷如脊柱裂、脑膨出和先天性心脏缺陷而在胚胎期、妊娠中期或出生后不久就死亡。杂合突变Pax3小鼠Spl(+/-)主要特征是腹部、尾部和足部出现斑片状色素缺失。人的PAX3杂合突变导致轻度的WS1表型，而纯合或复合杂合PAX3突变则导致严重的WS3表型，如脑膨出、脊柱裂和上肢发育畸形，部分病例导致患儿在胚胎期或婴儿期死亡[13]。PAX3基因突变包括错义突变、无义突变、移码突变、小的碱基插入和缺失、剪切位点改变。目前已经报道的致WS的PAX3基因突变共有98种(http：//hearing.harvard.edu/genepages/pax3dream.html)，其中致WS1基因突变80种，致WS3基因突变18种，一半是错义突变，一半是无义或移码突变，也有部分或全基因缺失突变报道[2]。约95%的突变位点位于2～5号外显子，其中2号外显子的突变发生率最高，其次为5、6号外显子[3]。90%的WS1患者和50%的WS3患者中能检测到PAX3突变[3]。

3 PAX3基因在WS发病中的作用

NC由神经嵴细胞(neural crest cell，NCC)组成，是起源于背神经管的多潜能细胞群。脊椎动物NCC在胚胎发育早期即出现在背神经管中，在沿背神经管迁徙的过程中逐渐分化为黑素细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、骨和软骨细胞以及内分泌细胞，参与许多组织的发育并逐渐分化为NC源性衍生物，包括肌肉骨骼系统、循环系统、内分泌腺、周围神经系统和黑素细胞[14，15]。由于NCC发育不全导致的这些组织和细胞的病变统称为神经嵴病，约有20余种，WS即为其中之一。从NC分化为黑素细胞是一较为复杂的过程，NCC通过增殖、迁徙、生存、分化等过程逐渐演变为黑素前体细胞后到达真皮、表皮、内耳血管纹和眼睛的脉络膜，并开始发育为黑素细胞[16～18]。黑素细胞最重要的功能是产生黑色素以确保毛发和皮肤的色素沉着[19～21]。PAX3参与上述生理过程并在NC的发育中发挥重要的调控作用[3]。PAX3基因突变必然会造成NC、NC源性组织和细胞的发育异常，进而导致黑素细胞发育不良，黑色素合成减少，表现为皮肤、毛发、虹膜低色素。血管纹是内耳耳蜗结构之一，在内淋巴生成过程中起重要作用，动物模型研究[22]显示黑素细胞发育不良会引起血管纹中黑素细胞源性的中间细胞缺乏进而造成柯蒂器退化变性，最终导致感音神经性聋。同时由于颅面骨、四肢骨骼肌肉均来源于胚胎的NC，因此NC的发育异常必然会导致这些组织和器官的发育异常，从而产生了WS的一系列伴随症状。

3.1PAX3基因对NC发育的调控 PAX3基因在胚胎NC的发育中起关键作用，NC的发育依赖PAX3的正常功能。人和小鼠的PAX3基因表达水平下调时就会影响NC的正常发育。PAX3主要通过调控c-RET、Wnt1和转化生长因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)的表达促进NC迁徙、生存和增殖[4，7，23，24]，c-RET、Wnt1和TGF-β2是NC发育的关键调控因子。c-RET跨越NCC源性细胞胞膜，参与NCC的迁徙与增殖[5，25]。Wnt1参与神经嵴分化[26]，缺乏PAX3表达的小鼠胚胎背神经管中的Wnt1表达减少。TFG-β2参与NCC分化与凋亡[27]，TGF-β2纯和突变小鼠可出现神经嵴病，影响心脏、颅面骨结构、泌尿生殖系统和内耳发育，PAX3敲除小鼠胚胎的TGF-β2表达明显减少。

3.2PAX3对黑素细胞发育的调控 PAX3在黑素细胞增殖、抗凋亡、迁徙、细胞系特异分化中起重要作用[4]。MITF、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1，TRP1)和多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase，DCT)是黑素细胞发育和黑色素合成中关键性和标志性调控因子。在黑素细胞的发育中，PAX3主要通过直接或与其它转录因子协同作用激活或抑制MITF、DCT和TRP1的表达，参与调控黑素细胞的生长、发育与分化[4，28]，既能促进也能抑制黑色素合成。MITF和TYRP1是PAX3直接调控的下游靶基因，PAX3可直接上调TYRP1表达[29]，使黑素细胞产生黑色素。PAX3单独上调MITF表达的能力较弱，需与SOX10相互作用协同激活并上调MITF转录，二者在MITF启动子上的DNA结合位点仅相差一个碱基[8，30]。PAX3通过PD域和HD域与MITF转录起始点上游的顺式作用元件结合后调控MITF的表达来影响成黑素细胞向黑素细胞发展[29]。PAX3基因通过和淋巴增强因子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF1)及Groucho相关蛋白4(Groucho-related protein 4，Grg4)在DCT增强子上形成复合体阻止MITF与DCT的结合而抑制DCT表达[4]，PAX3基因通过抑制DCT表达、阻止MITF与DCT启动子结合来防止终末分化因子的表达。但当β-catenin存在时，LEF1与MITF形成蛋白复合体并使PAX3基因离开DCT增强子，MITF进而上调DCT表达。尽管黑素细胞发育调控机制的整个分子途径还不清楚，但PAX3对MITF、DCT和TYRP1三个基因的调控代表了整个机制的一部分，其作用在于使黑素干细胞向黑素细胞分化的同时阻止其终末分化并保证黑素细胞的增殖，维持其生长。

PAX3基因还可通过与其他蛋白相互作用来完成对下游基因转录的抑制或激活而影响它们的表达[7，31]，进而影响黑素细胞的发育。SOX10和TAZ蛋白(tafazzin，亦称WW domain-containing transcriptional regulator 1，WWTR1，双W域转录调控因子1)可以增强PAX3的转录活性，PAX3和SOX10通过他们的DNA结合位点直接作用协同激活MITF和c-RET的表达。

3.3PAX3基因突变致WS发病的分子机制研究 多数研究[8，10，29，32]认为突变影响PAX3与DNA结合活性，导致PAX3蛋白功能降低或丧失，最终以单倍体剂量不足效应(haploinsufficiency)导致WS。目前发现的30多个错义突变位点几乎全部位于PD域和HD域，PD域突变通过影响PAX3与DNA的结合而导致PAX3蛋白功能减弱或丧失，使得其下调或失去对靶基因表达的调控作用[10]。HD域突变通过破坏维持HD域构象而影响HD域折叠的稳定性，进而影响其与DNA结合[33，34]。无义突变或移码突变影响PAX3与SOX10相互作用而下调靶基因MITF表达，进而影响黑色素合成[7]。Matsunaga[32]通过分析PAX3-DNA复合体的三维晶体结构预测PD域的无义突变可使PAX3与DNA的结合力减弱或丧失而影响PAX3蛋白功能，进而导致WS1。也有研究[8，35]认为位于PD和HD的突变可使PAX3蛋白入核动力及亚细胞定位发生改变而致蛋白功能下降或丧失，最终导致WS。而位于PD和HD之外的突变不影响PAX3亚细胞定位，而是通过异位剪切导致PAX3功能不良而致WS。

4 展望

目前PAX3基因导致WS的发病机制还不是很清楚，相关研究主要以体外实验分子水平研究为主，不能完全模拟和反映机体内WS的发生，这需要在体内实验动物水平进一步研究WS发病的分子机制。NC及NC源性细胞和组织的发育是一个十分复杂的网络调控体系，尽管PAX3在NC和黑素细胞发育过程中调控作用开始逐步被认识，仍有许多问题有待解决，PAX3基因调控NC发育的具体机制、PAX3转录活性被调控的机制、PAX3蛋白化学修饰对其功能的影响、潜在的PAX3基因调控的下游靶基因、PAX3基因剂量在WS发病中的生理病理作用等，有待于逐步阐明，以便更明确地认识PAX3基因在NC发育与WS发生中的作用。

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