通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微 血管内皮细胞BDNF表达的影响❋

郭晓谨，周梦佳，李 峰，李芳赫，万亮琴，张 赛， 马家宝，李卫红△，李兴广△

(1．北京中医药大学，北京 100029；2. 通州中西医结合医院，北京 101100)

近年来研究表明，脑缺血后受损的脑组织可出现神奇的再塑性，神经元发生的机制与血管发生有重要的相关性，所以促进缺血后的血管新生成为脑缺血后治疗的新思路[1]。通络救脑注射液是由栀子苷和三七总皂苷2种组分配伍而成的现代注射剂。前期研究显示，通络救脑注射液及其2组分均可有效提高拟缺血损伤内皮细胞活性，减轻缺血内皮细胞的氧化应激损伤，且2组分在发挥抗氧化作用途径方面各有所侧重[2]。本实验在前期研究基础上，观察通络救脑注射液及其2有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞BDNF的表达影响，从血管再生因子角度阐释该注射液的药效及配伍机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

原代的大鼠脑微血管内皮细胞，采用实验室已建立的方法[3]进行内皮细胞的分离纯化和培养。

1.2 拟缺血损伤模型的制备

采用本实验室已建立的糖氧剥夺模型[4]，细胞传至第三代，用无糖的Kreb’s液置换原培养基，放入低氧培养箱(气体含量为94%N2，5%CO2，1%O2)，37℃继续培养6h。

1.3 实验分组与处理

培养的脑微血管内皮细胞分成5组，分别为正常组、模型组、栀子苷组、三七总皂苷组、通络救脑注射液组。除正常组外，其余各组均按上述方法造模。各给药组分别按栀子苷33.2 μg/ml、三七总皂苷22 μg/ml、通络救脑注射液55.2 μg/ml的药物浓度在造模前3 h以及造模过程中给药，处理结束后进行指标检测。

1.4 western blotting法检测各组微血管内皮细胞BDNF的表达

用细胞刮收集各组内皮细胞，在冰上用细胞破碎机破碎，离心后取上清，BCA 法检测蛋白定量。配制聚丙烯酰胺凝胶，将变性蛋白样品加入缓冲液，蛋白凝胶电泳，然后转膜(PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜上的蛋白潜在结合位点，分别加入一抗，4℃过夜，加入二抗后ECL试剂显色、照相。

1.5 免疫荧光法检测各组微血管内皮细胞BDNF的表达

将各组微血管内皮细胞在4%的多聚甲醛中固定10min，l% TritonX-100透化处理2～3 min，5%BSA封闭1 h后，加入5%BSA稀释的一抗4℃过夜。5%BSA稀释的荧光标记的二抗于37℃孵育1 h。用ProLong Gold antirade reagent with DAPI抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并照相。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 western blotting检测BDNF的表达情况

图1显示，与正常组比较，脑微血管内皮细胞拟缺血损伤后BDNF的表达量明显增加(P<0.05)；与模型组比较，栀子苷组BDNF的表达有所升高，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；三七总皂苷组与通络救脑注射液组BDNF的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 western blotting检测BDNF的结果注：与正常对照组比较:*P<0.05；与模型组比较:# P<0.05

2.2 免疫荧光法检测的BDNF的表达情况

图2显示，荧光显微镜下各组细胞BDNF表达均呈阳性，浅色荧光颗粒主要位于胞浆，尤其是核周。正常组细胞胞体较大，浅色荧光相对较弱；模型组细胞回缩明显，变得细长，细胞间隙变大，荧光强度明显变强；3个给药组的荧光强度进一步增强，尤其是三七总皂苷组与通络救脑注射液组增强明显，结果与western blotting相一致。

3 讨论

血管新生是指在原有血管基础上通过血管内皮细胞增殖、游走、芽生、血管分裂及分支而形成新的毛细血管网，使其功能与局部需要相适应的生物学过程[5]。脑缺血中后期缺血半暗带开始出现血管新生，损伤部位新生的侧支血管可以改善缺血区周围的血液供应，血管新生可能为神经元的重构提供了关键的神经血管底物。研究表明，脑组织血管密度高的卒中患者预后明显好于血管密度低的患者，脑血管新生可明显改善缺血区周围的组织灌注，弥补因血流量不足导致的脑损伤，缩小脑梗死体积，重塑神经结构，使神经功能尽快尽可能恢复[6]。因此，促进血管新生成为治疗脑缺血的一条有效途径。

图2 免疫荧光法检测BDNF的结果注：A.正常组；B.模型组；C.栀子苷组；D.三七总皂苷组；E.通络救脑注射液组

BDNF是一类多功能的多肽因子，是神经营养因子家族中的一员[7]，它广泛分布于中枢神经系统，包括海马、小脑、大脑皮质等。BDNF除在神经系统中起重要作用外，还在维持血管内皮细胞的存活、促进缺血部位内皮细胞的增殖中发挥重要作用，是一种重要的血管再生因子。研究显示，多发性骨髓瘤细胞患者血浆中BDNF水平明显升高，可能与参与骨髓瘤细胞诱导血管新生有关[8]。王雅丹等[1]认为，脑源性神经营养因子通过AKT和ERK1/2信号通路诱导内皮细胞血管生成。从本实验的结果来看，内皮细胞拟缺血损伤后BDNF的表达较正常组明显升高，提示氧糖剥夺的刺激启动了内皮细胞的自修复机制，BDNF可能参与内皮细胞的自修复。与模型组比较，栀子苷组BDNF的表达有所升高，但无统计学意义；三七总皂苷与通络救脑注射液组比较，模型组BDNF的表达明显升高，差异有统计学意义。结果提示，三七总皂苷与通络救脑注射液对拟缺血内皮细胞BDNF的表达具有显著上调作用，这可能是其发挥血管保护和促进血管新生作用的机制之一，但栀子苷在这一环节作用不明显。

综上所述，通络救脑注射液可明显提高缺血后内皮细胞促血管再生性因子BDNF的表达，这对改善微血管再生环境、促进脑缺血损伤后微血管的新生、从而有效恢复缺血区血液供应具有重要意义，可能是该注射液发挥脑保护的内在机制之一。2有效

组分中三七总皂苷对BDNF的表达有显著上调作用，而栀子苷在上调BDNF环节作用不明显，提示2组分在发挥促血管再生方面，三七总皂苷可能作用更为突出。

[1] Chopp M，Zhang ZG，Jiang Q. Neurogenesis，angiogenesis and MRI indices of functional recovery from stroke [J]. Stroke，2007，38(2)：827-831.

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[3] 李卫红，李澎涛，华茜，等. 不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用[J]．中国中西医结合杂志，2007，27(2)：131-134．

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