强力接骨胶囊在骨折愈合早中期对BMP表达影响的应用基础研究❋

李勇强，曹永登，侯 宇，李 霞，李晓燕，邵雅华，黄 葳，张 丽，师青春，滕义和

(黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150001)

骨挫伤和骨折是骨伤科临床的常见病、多发病，如何促进骨折愈合特别是骨质疏松患者的骨质愈合一直是骨科研究的热点问题。现代医学多从基因水平揭示骨折愈合的作用机制，BMPs影响骨折愈合是目前现代医学研究的重要内容。强力接骨胶囊具有活血化瘀、补益肝肾、接骨续筋的功效，在我院已有20多年临床应用，具有副作用少、疗效确切、经济简便的独特优势，而强力接骨胶囊如何促进骨折愈合的现代研究尚属空白。笔者拟从分子生物学水平、以骨折端骨形态发生蛋白-2(BMP-2)含量的变化作为主要研究内容，对强力接骨胶囊在骨折愈合早中期BMP-2表达的影响进行了探讨，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料

健康成年新西兰长耳大白兔90只，雌雄各半，平均兔龄8.4个月，平均体质量2.3 kg，由黑龙江省中医药科学院实验动物中心统一提供；强力接骨胶囊，由本院(省级三甲医院)制剂室按国家药品标准制成口服胶囊制剂；骨折挫伤胶囊，由哈高科佳木斯中药有限公司生产；1%BMP第一抗体细胞抗BMP单克隆抗体工作溶液，由第四军医大学口腔医院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 把90只兔随机分为用药组、对照组、空白组，分组后用咬骨钳在桡骨中下1/3处造成0.4 cm骨缺损的骨折模型，用手术缝合线仔细逐层缝合肌肉、皮下组织、皮肤，并用无菌纱布包扎，不做任何固定。

1.2.2 给药方法 造模后第2天开始用药组以0.5 g/(kg·d)标准喂服强力接骨胶囊，对照组以0.3 g/(kg·d)标准喂服骨折挫伤胶囊，空白组喂以白开水。所有实验动物由专门技术人员在同一实验条件下统一喂养和管理。

1.3 标本取材

将3组分别于骨折后用药1～5周后，从各组中分别随机抽出6只大白兔，通过耳缘静脉推入40 ml空气，利用静脉空气栓塞法使其致死。以骨折端为中心取出4.0 cm骨质，剔除骨质上软组织及皮肤，保留骨折端上的骨痂，作为实验用标本。

1.4 组织学标本制备

实验标本用4﹪多聚甲醛溶液浸泡固定，再用EDTA进行脱钙，最后用石蜡包埋并切片。每组切片中隔3张抽1张进行苏木紫-伊红(HE)染色并进行组织学观察，余下切片进行免疫组化BMP-2染色。

1.5 免疫组化检测

按照BMP-2免疫组化试剂盒操作方法，对切片进行免疫组化染色。切片染色后，通过与计算机相连的显微镜，在显微镜放大400倍的情况下将采集到的免疫组化切片图像存入计算机，并用病理图像分析系统对其进行分析。然后采用彩色分割方法，分割免疫组化切片图像中BMP-2阳性产物区域，从而求出阳性产物平均光密度值和阳性平均积分光密度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色观察

术后1周，用药组在骨折断端可见大量骨痂生成，骨痂局部可见大量的成纤维细胞、成骨细胞和软骨细胞，以成纤维细胞为主且分化较成熟，并有少量骨小梁的形成。对照组骨折断端可见较多成纤维细胞和软骨细胞，但幼稚细胞多见。空白组骨折断端成纤维细胞、软骨细胞数量最少且排列稀疏。空白、对照组均未见骨小梁的形成。

术后2周，用药组骨折断端可见较多的骨小梁形成，并有大量的软骨细胞、成骨细胞，且软骨细胞大多分化成熟，成骨细胞较大，成纤维细胞数量较1周前减少。对照组可见大量的成纤维细胞，成骨细胞、软骨细胞相对较少，且分化较成熟。空白组成纤维细胞较多，分化较成熟的成骨细胞、软骨细胞少见。空白组、对照组可见骨小梁形成但排列稀疏。

术后3周，用药组骨小梁进一步增多，排列整齐致密的成骨细胞、骨细胞多见，同时出现少量破骨细胞。对照组成骨细胞数量增多，成纤维细胞减少；空白组成纤维细胞增多。

术后4周，用药组可见大量成熟的骨细胞，并有板层骨、破骨细胞增多。对照组可见较多成骨细胞，并可见少量骨细胞。空白组成纤维细胞减少，可见成骨细胞，少量骨细胞。

术后5周，用药组可见大量骨小梁形成，骨细胞排列致密整齐且大都形成桥接，并可见致密性骨皮质。对照组可见大量成骨细胞、较多骨细胞、骨小梁增多，大部分未形成桥接，致密性骨皮质少见。空白组成骨细胞增多，未见桥接形成。

2.2 免疫组化染色观察

术后1周，用药组出现大量的纤维性骨痂，骨痂中有较多的BMP-2强阳性染色细胞。对照组可见少量纤维性骨痂，空白组未见明显的纤维性骨痂。成纤维细胞中对照组BMP-2呈弱阳性表达，空白组未见明显染色。

术后2周，用药组的成骨细胞、细胞外基质、间充质细胞染色明显增强，BMP-2阳性表达程度强。对照组成骨细胞、间充质细胞呈阳性表达，但染色明显浅于用药组。空白组亦可见BMP-2阳性细胞表达，但在数量、着色方面较用药组更少。

术后3周，用药组的BMP-2的阳性表达减弱，对照组、空白组阳性表达已增强，但三组比较，在表达上用药组最强，对照组次之，空白组最弱。

术后4周，用药组阳性细胞表达的数量、范围减少，且成熟的软骨细胞未见明显的阳性染色，成熟骨细胞染色浅。对照组、空白组阳性细胞表达增多，范围加大，但着色较用药组浅。

术后5周，用药组阳性细胞表达数量、范围进一步减少，成熟骨细胞未见明显染色。对照组、空白组阳性细胞表达范围较前增多，软骨细胞、骨细胞可有较浅的染色。

所有切片中骨痂局部BMP-2含量最高，成熟骨细胞未见明显的阳性染色。纵向比较，3组术后阳性表达细胞BMP-2呈“少→多→少”的含量变化，但用药组染色高峰出现在术后2周，对照组、空白组染色高峰相对延后，空白组出现最晚。横向比较，用药组阳性染色最强，对照组次之，空白组最弱，术后第1、2周最为明显。阳性产物平均光密度值和阳性产物平均积分光密度见表1、2。

表1 不同观察时间骨痂中BMP-2表达光密度均值

注：用药组与空白组、对照组比较：*P<0.05

表2 不同观察时间骨痂中BMP-2表达平均积分光密度

注：用药组与空白组、对照组比较：*P<0.05

3 讨论

骨折的愈合是机体损伤后复杂的组织学和生物化学变化过程，需要许多不同的细胞、生长因子参与修复，其中BMP-2在骨折愈合过程中起重要作用。其通过调节、诱导骨组织，使组织中未分化的间充质细胞迁徙、增殖、分化，从而调节及诱导成骨细胞、成软骨细胞的生长，促进骨、软骨组织形态形成，分化成为骨细胞、软骨细胞。侯晓峰等[1]在鹿茸对实验型骨折愈合中BMP-2表达影响的研究中，发现BMP能刺激间充质细胞的分化，对干性成骨细胞及诱导性成骨母细胞，BMP能刺激其分化成为软骨细胞及骨细胞，从而形成软骨及骨组织。毕锴、温建民等[2]在中医骨折三期治疗对家兔骨折愈合中VEGF与BMP-2表达影响的实验研究中，通过对家兔骨折愈合过程中BMP-2的免疫组化检查的图像分析，发现中医药在治疗骨折中能显著促进骨折愈合中BMP-2的表达。周成洪等[3]在探究接骨3号方对

兔挠骨骨折术后BMP-2表达影响的研究中发现，接骨3号方在骨折愈合过程中对BMP-2的持续表达有明显的促进作用。BMP-2有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，且已在体内和体外的实验中得到证实[4]。吴剑静等[5]在仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞矿化结节及BMP-2表达影响的实验研究发现，仙鹿健骨汤含药血清不仅能促进体外培养的新生SD大鼠成骨细胞矿化功能，促进矿化结节的形成，还能提高新生SD大鼠成骨细胞中BMP-2的表达水平，增加骨细胞的形成。多数学者认为，中药可以促进骨折部位骨基质钙盐沉积，提高骨痂质量，促进生长激素分泌，可以提高BMP的含量，促进成骨细胞分泌TGF-β，对IGF-1的产生有促进作用[6～8]。

在本次实验中，术后1周属于纤维骨痂阶段，成纤维细胞增生活跃。用药组在术后1周纤维骨痂大量增生，多于对照组，远多于空白组，局部骨痂BMP-2的阳性表达均强于对照组和空白组。术后2～3周，骨折的愈合逐渐由纤维骨痂阶段进入软骨成骨阶段。此时间充质细胞大量增殖、分化为成骨细胞，成骨细胞功能异常活跃，BMP-2的含量最多、表达最强。用药组BMP-2出现高峰在2周，比对照组提前1周出现，同时BMP-2表达的强度也明显强于对照组和空白组。术后4～5周，骨折愈合开始转入骨痂的修复与塑型阶段。成骨细胞逐渐减少，骨小梁、板层骨不断构建完成，同时在塑型期破骨细胞不断增多，而由于成熟骨细胞的不断增多，阳性细胞数量的表达不断减少，着色较浅。从整个实验过程中可以看出，用药组的BMP-2阳性表达程度上较对照组、空白组强，数量较对照组和空白组多，峰值出现的时间较对照组、空白组早。由此可推测，强力接骨胶囊对BMP-2的合成、分泌有促进作用，并影响其分布和改变其表达时间与表达量，从而起到促进骨折愈合的作用。

中医药治疗骨折依据整体观念把“瘀去、新生、骨和”作为理论，把握骨折各期的不同病理特点，结合骨折各期治则，运用中医药理论治疗各期病人。强力接骨胶囊根据以上理论研制而成，经过多年的临床实践探索，方选当归、红花、续断等23味中药，意在活血化瘀、接骨续筋、补益肝肾、调理气血。强力接骨胶囊在临床应用上已有20多年的临床应用基础，疗效颇多。但从未在分子生物学水平上阐述其机理。本实验研究采用对BMP-2的表达影响做一定的探索，从分子生物学水平阐述其对骨折的影响，但骨折愈合是十分复杂的过程，强力接骨胶囊对BMP-2表达的影响和确切机理还有待进一步研究。

[1] 侯晓峰，李朝旭，刘景生.鹿茸对实验型骨折愈合中BMP-2表达的影响[J].辽宁中医杂志，2005, 32 (4): 374-376.

[2] 毕锴，温建民，孙永生，等.中医骨折三期治疗对家兔骨折愈合中VEGF与BMP-2表达影响的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2012,12(18):1344-1347.

[3] 周成洪，龙亨国，詹旭.接骨3号方对兔挠骨骨折术后BMP-2表达的影响[J].中华中医药学刊,2012,30(6):1262-1267.

[4] Chen D, Harris MA.BMP-2 enhances BMP-3，BMP-4 and bone cell differentiation marker genes expression during the induction of mineralizal bone matrix formation incultures of fetal rat calvarial osteoblasts[J]. Calcif Tissue Int,1997,60 (3) :283.

[5] 吴剑静，康孟乐，王靖，等.仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞矿化结节及BMP-2表达影响的实验研究[J].浙江中医杂志，2010，45(2)：103-105.

[6] 李楠.补骨合剂对种植体-骨结合界面BMP含量变化的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2001，39(4):17.

[7] 程杰.生骨注射液对体外培养的大鼠成骨细胞BMP-2 mRNA表达的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2005, 13(2):203-204.

[8] 侯晓峰,刘景生.中药促进骨折愈合机理[J].中国中医骨伤科杂志，2003，1(11)：61-63.