健脾祛瘀法对血脂异常ApoE基因缺失小鼠视网膜RPE黑色素和脂褐素的影响❋

王 毅,李 娟,李进辉，李罗翔,曾庆华

(成都中医药大学附属医院，成都 610072)

世界卫生组织研究报告表明，年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration， AMD)致盲约占全球盲人的8.7%，全球约有3000万AMD患者，每年约有50万人因AMD致盲[1]。在我国，由于人口老龄化进程的加剧和饮食结构的变化，其他致盲原因得到或加强了控制，AMD日益成为重要致盲的眼病。AMD发病机理尚未明确，国内外研究将AMD相关危险因素总结为以下几项：RPE代谢功能衰退、年龄因素、遗传因素、环境影响、慢性光损伤、营养代谢失调、免疫性疾病、有毒物质侵害、心血管系统疾病等[2]。RPE代谢功能减退主要表现为黑色素减少和脂褐素的增多[3]，而研究发现在AMD眼中,抗RPE细胞氧化损伤的黑色素数量不断下降,且引起氧化损伤的脂褐素不断增多,使得视网膜RPE的合成分泌功能发生障碍[4]，因此RPE细胞代谢功能衰退与AMD互为因果，导致AMD发生，促进 AMD发展。现代医学对氧化损伤引起的AMD没有特殊的治疗方法，为此我们在前期已报道高脂喂养ApoE-/-小鼠能建立AMD模型[5,6]、健脾祛瘀法方药可通过降低血脂发挥对该模型AMD治疗作用的基础上[7]，进一步观察健脾祛瘀法对该模型视网膜RPE细胞黑色素和脂褐素的影响，以其更好地阐明健脾祛瘀法方药对AMD的治疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 ApoE-/-小鼠36只，8周龄，体质量21～23 g，由北京大学实验动物中心(美国Jackson实验室引进)提供。

1.1.2 饲料 普通饲料和高脂饲料均由成都达硕动物实验有限公司提供。

1.1.3 药物 健脾祛瘀中药配方颗粒(由生蒲黄、白术、丹参、牡丹皮、郁金等组成)由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供(批号1009049)。

1.1.4 试剂 血脂试剂盒由浙江伊利康生物技术有限公司提供(产品批号20080023号)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型和分组 实验分为5组，60只2月龄ApoE-/-小鼠随机分为普食组、高脂组、高、中、低治疗组，每组动物12只。前4个月普食组动物给予标准啮齿类动物饲料，其余4组动物给予高脂饲料，后1个月各治疗组给予健脾祛瘀中药配方颗粒，温开水稀释后灌胃，给药量按人与动物的体表面积计算法计算，高剂量组每只小鼠灌胃0.54 g/ml/100 g/d，中剂量组每只小鼠灌胃0.36 g/ml/100 g/d，低剂量组每只小鼠灌胃0.18 g/ml/100 g/d，普食组和高脂组给予等量生理盐水灌胃，每天2次，各组动物均给予标准啮齿类动物饲料，饲料与水均只有摄取，所有动物在装有清洁过滤器的笼子中饲养，温度保持在22～25 ℃，相对湿度50%，共饲养5月至7月龄。所有实验根据赫尔辛基宣言和保护及运用动物的指导原则来进行。

1.2.2 血浆总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯检测 禁食8 h后，在动物宰杀前静脉注射镇静剂戊巴比妥钠，用肝素化的毛细血管采集股静脉血。使用日立7170全自动生化分析仪检测血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和血浆甘油三酯(TG)。

1.2.3 视网膜RPE形态结构观察和黑色素、脂褐素含量检测 摘小鼠左眼，每组共12只眼球，保留约1～2 mm长视神经，用锋利的刀片在角巩缘处切一三角形小口，放入FAA(酒精-甲醛-醋酸)液中固定1周，切取含视神经的冠状面眼球壁组织3～5 mm厚，逐级酒精脱水、石蜡包埋，切片4 um，行银氨液浸染法(Fontana)染色、醛品红法(参照Gomori)。银氨液浸染法(Fontana)染色结果为：黑色素呈黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色；醛品红法染色结果为：脂褐素呈深紫色，肥大细胞胞质内的颗粒呈紫色，背景呈淡黄色。光镜下观察染色切片，首先在低倍视野下(100×)观察眼球壁各层组织结构，然后在中倍(200×)下观察RPE形态结构，选择视乳头两端视网膜各5个视野，共计10个视野，采用Mias 2000图像分析系统(四川川大智胜软件股份有限公司)半定量检测视网膜RPE胞质内黑色素和脂褐素面积，计算每个视野RPE细胞内黑色素、脂褐素面积，表示黑色素和脂褐素含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠血浆TC、LDL、TG比较

表1显示，与7月龄ApoE-/-高脂组小鼠比较，7月龄ApoE-/-普食组和高、中、低治疗组小鼠血浆TC和TG明显降低，差异有统计学意义(P<0.05～0.001), 7月龄ApoE-/-普食组和高、中治疗组小鼠血浆LDL明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，低剂量治疗组小鼠血浆LDL降低，差异无统计学意义(P>0.05)，提示健脾祛瘀法方药可以降低高脂喂养的ApoE-/-小鼠高血脂。

表1 各组小鼠血浆TC、LDL、TG检测结果

注：与7月龄ApoE-/-高脂组比较：※P<0.05，▲P<0.01,△P<0.001

2.2 各组小鼠视网膜RPE形态结构观察和胞浆内黑色素、脂褐素含量检测结果

光镜下可见，7月龄ApoE-/-高脂组小鼠视网膜色素上皮细胞排列紊乱、稀疏和细胞萎缩，胞浆内呈黑色的黑色素分布稀疏，量少，呈深紫色的脂褐素分布密集、重叠，量多；7月龄ApoE-/-普食组小鼠视网膜RPE排列较紊乱、稀疏，细胞萎缩程度减轻，胞浆内黑色素较密集，量较多，脂褐素分布较密集，量较多；7月龄高、中、低治疗组小鼠视网膜RPE排列较整齐，未见明显细胞稀疏、萎缩，胞浆内黑色素分布密集，量多，脂褐素分布较稀疏，量减少。

表2显示，7月龄高、中、低治疗组小鼠RPE胞浆黑色素含量及黑色素/脂褐素比值均比7月龄ApoE-/-高脂组小鼠增多，差异有统计学意义(P<0.001)，7月龄高、中、低治疗组小鼠RPE胞浆脂褐素含量比7月龄ApoE-/-高脂组小鼠减少，差异有统计学意义(P<0.001)。7月龄ApoE-/-高脂组小鼠视网膜RPE胞浆黑色素含量、黑色素/脂褐素比值均比7月龄ApoE-/-普食组小鼠减少，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，7月龄ApoE-/-高脂组小鼠视网膜RPE胞浆脂褐素含量比7月龄ApoE-/-普食组小鼠增多，差异有统计学意义(P<0.01)(图1～图6)。

多元线性回归分析发现，小鼠RPE细胞内黑色素含量与TC、LDL、TG呈线性负相关(TC、γ=-0.606，P=0.000；LDL、γ=-0.372，P=0.043;TG、γ=-0.496,p=0.005)。回归方程：黑色素积分光密度=1837732.32-63225.96×胆固醇，小鼠RPE细胞内脂褐素含量与TC、TG呈线性正相关(TC、γ=0.918，P=0.000；TG、γ=0.734，P=0.001)；回归方程：脂褐素积分光密度=418363.52+139394.42×胆固醇，小鼠RPE细胞内黑色素/脂褐素比值与TC、TG呈线性负相关(TC、γ=-0.904，P=0.000；TG、γ=-0.675，P=0.002)；回归方程：黑色素/脂褐素=2.057-0.127×胆固醇。

表2 各组小鼠视网膜RPE细胞内黑色素、脂褐素积分光密度及黑色素/脂褐素比值

注：与7月龄ApoE-/-高脂组比较：※P<0.05，▲P<0.01,△P<0.001

图1 普食组，Fontana染色(×400)

图2 高脂组，Fontana染色(×400)

图3 高剂量治疗组，Fontana染色(×400)

图4 普食组，醛品红法染色(×400)

图5 高脂组，醛品红法染色(×400)

图6 高剂量治疗组，醛品红法染色(×400)

3 讨论

AMD属中医学“视瞻昏渺”、“视瞻有色”范畴，本病与肝、脾、肾三脏相关，为本虚标实、虚实夹杂之证[8]， 特别认为黄斑属脾所主，脾肾亏虚则气化乏源，运化失权，水湿痰浊应运而生，久病而郁，郁久而瘀[9,10]。梁晋普等[11]认为，高脂血症的关键病机可以概括为痰瘀互结，而病理过程的进一步发展，痰瘀互结沉积血府。本次研究通过建立血脂异常ApoE-/-小鼠AMD动物模型，并按循经选药原则组方，具体由生蒲黄、白术、丹参、牡丹皮、郁金等药物组成，共奏健脾祛瘀之功。实验结果显示，高、中、低治疗组小鼠血浆总胆固醇、血浆甘油三酯比高脂组小鼠显著降低(P<0.01～0.001)，高、中治疗组小鼠血浆低密度脂蛋白比高脂组小鼠显著降低(P<0.001)，低剂量治疗组小鼠血浆低密度脂蛋白比高脂组小鼠降低(P>0.05),表明健脾祛瘀法方药可通过祛除痰瘀互结、阻断痰瘀互结降低ApoE-/-小鼠高脂血症。

血脂异常可以导致视网膜RPE的形态损害，从而引起RPE功能代谢损害[12]。RPE功能代谢损伤主要表现为胞浆内黑色素减少，脂褐素增多。黑色素被认为是视网膜中的1种抗氧化剂,其抗氧化作用机制主要是吸收可见光光子的能量以及中和活性氧和活性自由基,减少视网膜的光学和氧化损伤[13]。一旦RPE胞浆黑色素减少将降低视网膜的抗光学和氧化损伤，导致视网膜光感受器、RPE和Bruch损伤，出现AMD[14]。前期我们已经报道高脂喂养ApoE-/-小鼠可出现AMD[5,6]，本次实验结果观察到高脂组小鼠视网膜RPE不同程度排列紊乱，细胞萎缩，同时发现受损的RPE细胞胞浆内黑色素含量明显减少，高、中、低治疗组可改善视网膜RPE形态结构，同时可提高RPE细胞胞浆内黑色素含量，表现为各治疗组小鼠视网膜RPE细胞内黑色素含量比高脂组显著增多(P<0.001)。揭示健脾祛瘀法方药可通过降低血脂，改善RPE形态结构，保护RPE细胞存活，提高视网膜RPE抗氧化剂黑色素含量，减轻RPE氧化损伤和RPE细胞功能代谢损害，发挥对AMD的治疗作用。

脂褐素是1种会产生自由基的物质，由RPE细胞生理性吞噬视网膜感光细胞部分外节段后所残留的部分形成，与RPE的吞噬能力下降有关，它对自由基链式反应起到催化作用，其效应是以引起RPE细胞主要成分的光氧化[15]。AMD的发病与脂褐素在RPE细胞的堆积密切相关，脂褐素被认为是细胞老化和氧化损伤的生物指标，蕃茄红素可以通过清除上皮细胞自由基及抗脂质过氧化来抑制脂褐素的形成，从而阻止AMD的发生[16]。本次实验结果发现，高脂组小鼠视网膜RPE细胞胞浆内脂褐素含量多，高、中、低治疗组小鼠视网膜RPE细胞脂褐素比高脂组显著降低(P<0.001)，显示健脾祛瘀法方药还可通过抗RPE细胞氧化损伤，降低视网膜RPE氧化剂脂褐素生成，保护RPE结构和功能，达到治疗AMD的作用。

本次实验结果还发现，高脂组小鼠视网膜RPE细胞黑色素/脂褐素比值低，高、中、低治疗组小鼠视网膜RPE细胞黑色素/脂褐素比值比高脂组小鼠明显增高(P<0.001)，表明健脾祛瘀法方药不仅能提高抗RPE细胞氧化损伤的黑色素绝对量、降低氧化损伤的脂褐素的绝对量，还可以提高抗氧化与氧化力量对比中抗氧化的相对力量，从而增强RPE抗氧化能力，减轻RPE细胞损伤，改善RPE细胞功能代谢，发挥治疗AMD作用。

多元线性回归分析发现，RPE黑色素含量与血浆TC、LDL、TG呈负直线相关，脂褐素含量与血浆TC、TG呈正直线相关，黑色素/脂褐素比值与血浆TC、TG呈负相关，表明血脂异常可直接影响黑色素、脂褐素及黑色素/脂褐素比值，血脂异常增高可引起RPE抗氧化作用的黑色素减少，RPE氧化作用的脂褐素增加，同时导致黑色素/脂褐素比值降低。而健脾祛瘀法方药可通过降低血脂，从而提高黑色素含量，降低脂褐素含量，提高黑色素/脂褐素比值，发挥抗RPE细胞氧化损伤，达到治疗AMD效果。

现代药理学研究证实，健脾祛瘀法组方中蒲黄的有效成分为黄酮类物质，有钙离子拮抗剂样作用，且其中的槲皮素具有降脂、降压等多种药物作用；蒲黄提取物具有抗自由基、抑制脂质过氧化损伤的作用，并能保护细胞结构及其功能，从而延缓或减轻脑组织再灌注损伤，抑制胆固醇吸收，使胆固醇从肠道排出增加而达到降血脂的作用[17]；丹参能扩张微动脉，调节微循环障碍，还能改善血液流变的作用[18]；郁金有降低血脂的作用[19]；牡丹皮有抗血栓和抗动脉粥样硬化作用[20]；白术有抗衰老、增强机体网状内皮系统的吞噬功能，具有免疫调节作用[21]。 全方配伍具有降低血脂、改善血液流变学、抗自由基、抑制脂质过氧化、抗动脉粥样硬化等作用，对高脂、自由基、脂质过氧化等引起的AMD具有明显的疗效。

综上所述，健脾祛瘀法方药治疗AMD的机制之一，可能是通过降低血脂异常ApoE-/-小鼠高血脂，从而提高视网膜RPE细胞黑色素含量，降低RPE细胞脂褐素含量及提高黑色素/脂褐素比值，增强RPE细胞抗脂质过氧化能力，发挥治疗AMD的作用。

[1] Resnikoff S,Pascolini D,Etya ale D,et al.Global data on visual impairment in the year 2002[J]. Bull World Health Organ,2004,82:844-851.

[2] 周天球.年龄相关性黄斑变性的中西医治疗进展[J].交通医学,2011,25(3):228-232.

[3] Sparrow JR,Boulton M:RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology[J].Exp Eye Res，2005,80(5):595-606.

[4] 李文娟,彭清华.年龄相关性黄斑变性的病因学研究进展[J].国际眼科杂志,2011,11(9):1558-1560.

[5] 莫亚,曾庆华,谢礼丹,等.血脂异常对ApoE基因缺失小鼠视网膜及Bruch膜的影响[J].国际眼科杂志，2011,11(9):1518-1520.

[6] 王毅,李罗翔,李娟,等.ApoE基因缺失小鼠视网膜及Bruch膜组织形态观察[J].眼科新进展,2013,33(1):13-17.

[7] 王毅,马玉兰,李娟,等.健脾祛瘀法对血脂异常ApoE基因缺失小鼠视网膜和Bruch膜的影响[J].中华实验眼科杂志,2013,31(1):13-17.

[8] 和艳艳,朱莺.中医药治疗年龄相关性黄斑变性的研究进展[J].陕西中医,2010,31(12):1687-1688.

[9] 卢辉.年龄相关性黄斑变性中医药治疗进展[J].浙江中西医结合杂志，2011,21(4):291-293.

[10] 曾庆华,王丽英,张玲,等.年龄相关性黄斑变性发生机制与中医辨证分型的关系[J].四川中医，2004,22(2):13-14.

[11] 梁晋普,杨惠民,盛彤,等.载脂蛋白E基因多态性与高脂血症痰瘀证患者血脂水平关系的研究[J].中华中医药杂志，2008，23(7):633-635.

[12] 贾之祥,刘广峰,王禄娅,等.高脂血症和视网膜色素上皮层-Bruch-膜-脉络膜毛细血管复合体的相关性研究进展[J].眼科新进展,2011,31(8):789-792.

[13] 李文娟,彭清华.年龄相关性黄斑变性的病因学研究进展[J].国际眼科杂志,2011,11(9):1558-1560.

[14] Kim SR,Fishkin N,Kong J,et al.Rpe65 Leu450Met variant is associated with reduced levels of the retinal pigment epithelium lipofuscin fluorophores A2E and iso-A2E.Proc[J]. Natl Acad Sci USA，2004,101(32)11668-11672.

[15] Klein R,Deng Y,Klein BE,et al.Cardiovascular diese,its risk factors and treatment,and age-related macular degeneration :Women’s Health Initiative Sight Exam Ancillary Study[J].Am J Ophthalmol，2007,143(3):473-483.

[16] Sundelin SP,Nilsson SE.Lipofuscin-formation in retinal-pigmentepithelial cells is reduced by antioxidants[J].Free Radic BioMed,2001,31(2):217-225.

[17] 李震,王慧娟,郭东贵.蒲黄药理活性的研究进展[J].医药论坛杂志,2008,29(9):121-124.

[18] 赵娜,郭治昕,赵雪.丹参的化学成分与药理作用[J].国外医药·植物药分册，2007,22(4):155-160.

[19] 刘华钢,刘俊英,赖茂祥,等.郁金化学成分及药理作用的研究进展[J].广西中医学院学报，2008,11(2):81-86.

[20] 龙世林,陈雅.牡丹皮药理作用及临床研究进展[J].中国药业，2007,16(3):63-64.

[21] 杜培风,聂进红.白术研究综述[J].齐鲁药事，2004,23(9):14-34.