吉西他滨对胰腺癌PANC-1细胞中组蛋白去乙酰化酶及TMS1/ASC基因表达的影响

薛晓婕

基因甲基化是抑癌基因失活的主要机制。胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，发生隐匿，发展迅速，每年的平均发病率与平均死亡率相近，5年存活率不足5%。胰腺癌中许多抑癌基因因CpG岛异常超甲基化而失活，甲基化CpG结合蛋白通过与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)复合体相互作用而实现其抑制作用。甲基化抑制基因转录有赖于抑制性染色质环境。HDAC-1过表达可导致组蛋白去乙酰化。近年来，胰腺癌的辅助化疗对缓解临床症状，延长患者生存时间和提高生存质量有相当重要的意义。本实验通过观察HDAC的表达和TMS1/ASC启动子区域甲基化的状态研究吉西他滨(gemcitabine，GEM)治疗胰腺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料RPMI-1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司;GEM购自Sigma公司;胰腺癌细胞PANC-1购自中科院上海细胞库;蛋白抽提试剂盒购自Pierce公司;兔抗人HDAC-1多克隆抗体购自Santa Cruz公司;IgGHRP羊抗兔多克隆抗体购自北京中杉生物技术公司;HRP标记的β-actin单克隆抗体购自北京博奥森公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代:用0.25%的胰酶及0.02%的EDTA消化液消化PANC-1细胞，用含10%胎牛血清的1640培养基，在37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞融合率达70%时，以0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化并传代。

1.2.2 GEM对PANC-1胰腺癌细胞内TMS1/ASC的诱导:细胞生长状态良好时，取1×106/瓶传代接种于2个装有培养基的25 cm2培养瓶中，加入4.27 μg/ml GEM继续培养，未加入GEM的细胞作为对照组。

1.2.3 透射电镜观察细胞形态:EP管中收获细胞(5×106)，PBS洗涤2次。2%戊二醛固定样品15 min后，4℃，二甲胂酸钠缓冲液洗涤3次，15 min/次，接着1%锇酸固定30 min。然后PBS洗涤2次，5 min/次，再进行梯度脱水:20%、30%、50%、70%、90%乙醇分别于4℃下脱水2 min，100%乙醇室温下脱水2 min，100%乙醇4℃下脱水2 min。室温下渗透，丙酮:环氧树脂(1∶1)作用60 min，100%树脂作用60 min。37℃包埋12 h，60℃聚合48 h。在超薄切片机上先制成半薄切片，光镜下定位再制成超薄切片，醋酸铀染色10 min(避光)后，立即进行载网柠檬酸铅染10 min。然后用0.02 mol/L NaOH洗1次，双蒸水洗2次，滤纸吸水后，将铜网置于铺有滤纸的平皿中，半掩皿盖，灯下烘干保存。电镜下观察并拍摄照片。

1.2.4 HDAC-1蛋白水平检测:提取各组细胞总蛋白。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移2 h后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人HDAC-1多克隆抗体(1∶1000，Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2000)，室温轻摇2 h，洗膜，加入增强化学发光(ECL)反应液，暗室显影、定影后扫描。以β-actin作为内参照。

1.2.5 TMS1/ASC基因启动子区甲基化检测:按照DNA提取试剂盒(美国Omega公司)说明书提取细胞基因组DNA，进行重亚硫酸盐处理。具体步骤:取DNA约4 μg稀释至50 μl，加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，37℃变性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的对苯二酚及520 μl 3 mol/L NaHSO3(以10 mol/L的NaOH调整pH值至5.0)，混匀，避光，置于50℃水浴16 h。应用Wizard DNA纯化试剂盒(Promega公司)纯化修饰后的DNA。于室温下加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，放置15 min。加入2 μl 10 mg/ml糖原，66 μl 10 mol/L乙酸铵及450 μl冰乙醇过夜，离心，洗涤，室温下干燥，加60 μl TE(pH 8.0)溶解，-20℃保存。甲基化酶处理基因组DNA按照试剂说明操作步骤进行，使双链DNA上的胞嘧啶全部甲基化。

1.2.6 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)检测:以亚硫酸盐修饰后的DNA作为模板进行PCR扩增。反应体系:样品DNA 2 μl，10倍缓冲液5 μl，上下游引物各2 μl，dNTP 2.5 μl，Fast-Taq酶0.2 μl，去离子H20 36.3 μl。在Touchdown—PCR仪上进行扩增。反应条件:95℃5 min，94℃30 s，68℃30 s，72℃30 s，2个循环;94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，3个循环;94℃30 s，64℃30 s，72℃30 s，4个循环;94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，30个循环。以甲基化酶(SSSI)处理或未处理的正常人的外周血细胞DNA分别作为阳性和阴性对照。取部分PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，Bio-Rad自动成像仪成像。取部分PCR产物进行HhaI酶切，反应体系:PCR产物10 μl，去离子H2O 18 μl，10倍缓冲液Tango 2 μl，Hhal 2 μl，酶切8 h后行聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，EB染色，摄片。Quantity One软件进行灰度分析，并计算甲基化率。

1.3 统计学处理计量数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。所有多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEM对胰腺癌细胞PANC-1形态的影响GEM刺激PANC-1 24 h后，电镜发现细胞出现明显凋亡的形态学变化，绝大多数细胞发生核质疏松，核膜分层、起泡甚至破裂，核质溢出，胞浆也出现空泡，细胞膜和细胞器明显改变。见图1。

2.2 GEM刺激胰腺癌细胞PANC-1中HDAC的表达与对照组相比，经过GEM诱导的PANC-1中HDAC表达显著降低，并随诱导时间的延长其表达不断降低。见图2。

2.3 TMS1/ASC基因启动子区的甲基化状态甲基化率(%)=lane2/(lane1+lane2)×100%，因产物被酶切为52、53bp，故酶切后为两条带。对照组和GEM处理组TMS1/ASC基因启动子区的甲基化率分别为94.2%和17.3%，与GEM组比较，对照组TMS1/ASC基因启动子区的甲基化率明显升高(P＜0.01)。见图3。

图1 PANC-1细胞形态电镜照片(×6000)

图2 胰腺癌细胞PANC-1中HDAC的表达

图3 5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理前后胰腺癌PANC-1细胞株COBRA图

3 讨论

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，进展迅速，高度侵袭，化疗是胰腺癌综合治疗中的重要辅助手段之一，对化疗药物的正确选择将直接影响疗效，加之胰腺癌化疗极易出现耐药，胰腺癌临床治疗面临严峻的考验［1］。GEM作为一种脱氧胞苷类抗肿瘤药物，对实体瘤具有良好的抗肿瘤活性［2-3］。目前已作为临床恶性肿瘤化疗的一线用药。许多研究显示，基因启动子区CPG岛高甲基化可以导致抑癌基因静息，引起肿瘤的发生发展。死亡区域(DDF)的信号转导途径和激活机制是目前一项热门研究课题，TMSl/ASC基因包含有N—端PYD和C—端CARD结构的蛋白［4］。包含这种结构的TMS1/ASC基因编码蛋白可能在调节凋亡和免疫应答信号传导途径中起着关键作用。因此，由启动子区域异常甲基化而导致TMS1/ASC基因沉默，甲基化CpG结合蛋白可以通过与HDAC复合体相互作用而实现其抑制作用可能对癌细胞逃避凋亡有利［5］。

本实验采用透射电镜、蛋白印迹法和MSP技术，电镜结果显示，GEM刺激PANC-1 24 h后，其内部形态发生剧烈改变，GEM具有显著抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖的作用。蛋白印迹法揭示HDAC在GEM诱导的胰腺癌PANC-1细胞中的表达明显低于正常对照组，胰腺癌细胞株PANC-1中TMS1/ASC的启动子发生高频率的甲基化，通过基因启动子区域的甲基化导致TMS1/ASC沉默有利于胰腺癌细胞逃避凋亡，从而可能在胰腺癌的发生中起了一定的作用。GEM作为胰腺癌治疗的一线药物，可以通过抑制TMS1/ASC发生甲基化起到化疗的效果，也可以通过监测其甲基化的表达状态来观察化疗耐药情况，TMS1/ASC基因表达的下降可导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性下降。HDAC-1表达沉默后可使DNA组蛋白处于乙酰化状态，使DNA易于解聚，染色质呈转录活性结构，有利于转录因子与DNA模板相结合，进而激活一系列有关增殖凋亡调节、细胞分化的抑癌基因［6］。GEM治疗胰腺癌可能通过抑制TMS1/ASC甲基化和促进组蛋白乙酰化来发挥其化疗的作用。

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［5］闫红杰，齐晖，王云帅，等.组蛋白去甲基化酶1在干细胞增殖与分化中的调控作用［J］.生命科学，2012，24(7):646-653.

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