成人隐匿性自身免疫性糖尿病血浆糖蛋白磷脂酶D检测及其临床意义研究

秦 雯，梁瑜祯，夏 宁

流行病学研究显示，成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)占所有糖尿病患者的2%～12%[1]。国外2型糖尿病(T2DM)患者中LADA的发生率为2.8%～10.0%[2-3]；国内临床调查显示LADA约占T2DM患者的7%[4-5]。由于LADA常被误诊为T2DM，不利于尽早进行有针对性的治疗，所以对LADA的早期鉴别和诊断具有重要临床意义。目前LADA的早期诊断需要对种类繁多的自身抗体一一进行筛查，较为繁琐，临床开展不便，因此探寻一种更简便、经济的方法以早期诊断LADA是本研究的切入点。

诸多研究发现糖蛋白磷脂酶D(GPLD1)参与主要组织相容性复合体通路。主要组织相容性复合体是存在于大部分脊椎动物基因组中的一个基因家族，主要组织相容性复合体通路与代谢和免疫两大生物过程密切相关[6]。最近一项以阿尔及利亚人为背景的研究更是详细阐述了主要组织相容性复合体通路与1型糖尿病(T1DM)和LADA的密切联系，从侧面印证了GPLD1可能对T1DM和LADA产生影响[7]。因此，本研究通过观察早期LADA患者血浆GPLD1水平的变化，分析其与LADA的相关性及潜在的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 病例入选与排除标准 入选标准：经临床明确诊断为糖尿病，且采血前均未使用口服降糖药或胰岛素治疗。糖尿病诊断符合2003年美国糖尿病协会(ADA)的诊断标准。目前关于LADA 的诊断尚无统一标准，本研究基于以下几项标准诊断LADA[8-9]：(1)成年起病；(2)诊断糖尿病后至少半年内不需要行胰岛素治疗；(3)胰岛自身抗体阳性〔其中谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的特异度、敏感度相对较高，也是最持久的抗体，是目前诊断LADA最常用的筛查指标[10]〕。排除标准：(1)线粒体基因突变的糖尿病患者；(2)青少年起病的成人型糖尿病患者；(3)其他原因所致的糖尿病和妊娠期糖尿病患者；(4)其他自身免疫疾病患者。

1.2 临床资料 选取2011年8—12月广西医科大学第一附属医院来诊的符合研究条件的门诊患者(LADA组、T1DM组、T2DM组)及健康志愿者(NC组)，均在研究开始前签署受试者书面知情同意书。其中LADA组58例，年龄(37.2±5.1)岁；T1DM组52例，年龄(12.2±3.8)岁；T2DM组65例，年龄(38.2±4.7)岁；NC组83例，年龄(36.8±4.7)岁。

1.3 方法

1.3.1 血液标本的采集 4组受试者均在清晨空腹及早餐后2 h采静脉血，其中空腹血分为2份，1份分离血浆后于-80 ℃冰箱保存用于GPLD1的检测，另1份送本院检验科用于空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹C肽(FCP)的测定；餐后2 h血样用于餐后2 h血糖(2 hPG)、餐后2 h C肽(2 hCP)的测定。

1.3.2 观察指标的检测 FPG、2 hPG采用葡萄糖氧化酶法；HbA1c采用高效液相法；FCP、2 hCP采用化学发光法；GADA和GPLD1采用ELISA法。以上指标除GADA和GPLD1分别采用北京北方生物技术研究所和武汉优尔生公司的试剂盒自行测试外，其余均由本院检验科测试。

2 结果

2.1 临床资料比较 LADA组和T1DM组的年龄间差异有统计学意义(P<0.05)。LADA组、T1DM组及T2DM组的性别构成和病程间差异无统计学意义(P>0.05)。LADA组和其他3组的HbA1c、2 hPG、FCP、2 hCP间差异均有统计学意义(P<0.05)，LADA组与T1DM组、NC组FPG间差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。因T2DM组和NC组GADA均为阴性，未行统计学分析。

2.2 血浆GPLD1水平比较 LADA组与T1DM组血浆GPLD1水平间差异无统计学意义(P>0.05)；LADA组血浆GPLD1水平高于T2DM组和NC组(P<0.05，见表2)。

表2 4组受试者血浆GPLD1水平比较

注：GPLD1=糖蛋白磷脂酶D；与LADA组比较，*P<0.05

2.3 相关性分析及多因素线性回归分析 Spearman相关分析显示，血浆GPLD1水平与HbA1c、FPG、2 hPG呈线性正相关(P<0.05)，与FCP呈线性负相关(P<0.05，见表3)。以血浆GPLD1水平为因变量，以年龄、病程、HbA1c、FPG、2 hPG、FCP、2 hCP为自变量行多因素线性回归分析显示，仅FCP进入回归方程(P<0.05，见表4)。

表4 LADA患者GPLD1影响因素的多因素线性回归分析

Table4 Multiple linear regression analysis on influencing factors for GPLD1 in patients with LADA

回归系数标准误t值P值95%CI年龄0054064105550582(-0931， 1642)病程-01903068-18470071(-11830， 0494)HbA1c00811398902430809(-24692， 31505)FPG0081536402940770(-9196， 12352)2hPG-02656015-09560344(-17829， 6334)FCP-083268249-35430001(-378899，-104735)2hCP-004914318-04600648(-35339， 22179)

2.4 血浆GPLD1水平早期诊断LADA的ROC曲线 以GADA阳性作为LADA的参考标准，绘制ROC曲线(见图1)，计算AUC及95%CI。GPLD1早期诊断LADA的AUC为0.623〔95%CI(0.525,0.721)〕,最佳临界值为170.53 μg/ml，敏感度和特异度分别为76%和48%。

3 讨论

作为一种自身免疫性疾病，目前LADA的诊断主要依靠自身抗体的筛查。但自身抗体在LADA中的滴度通常较低易导致漏诊，故本研究旨在寻找可用于LADA早期诊断的临床指标。

GPLD1是一种大量存在于哺乳动物血浆中的酶，其功能尚未完全揭晓。人类GPLD1基因位于6号染色体，由25个外显子构成[11]。对于循环中GPLD1的来源有2种解释，有报道认为肝脏是人类循环血中GPLD1的主要来源，然而也有证据表明炎性反应细胞和胰腺内分泌腺也是GPLD1可能的来源。有研究表明人类血浆GPLD1中的氨基酸序列是与胰腺而不是肝脏cDNA编码的GPLD1氨基酸序列一致，提示人类循环血中的GPLD1很可能来自胰岛而不是肝脏。更有研究发现GPLD1与胰岛素共存于分泌颗粒中[12]，这就增加了自身免疫性糖尿病条件下GPLD1水平改变的可能性。Deeg等[13]在对T1DM鼠模型的研究中发现其GPLD1表达是上调的。Flores-Borja等[14]研究表明，鼠模型中GPLD1 mRNA水平的增加与其发展为胰岛素依赖性T1DM是同时的。总之，诸多研究发现GPLD1与胰岛功能及自身免疫性糖尿病密切相关。

图1 GPLD1早期诊断LADA的ROC曲线

组别例数性别(男/女)年龄(岁)病程(月)HbA1c(%)FPG(mmol/L)2hPG(mmol/L)FCP〔M(P25，P75)，μg/L〕2hCP(μg/L)GADA〔n(%)〕LADA组5832/26372±5148±1182±0892±17158±15071(063，076)12±0358(100)T1DM组5228/24122±38∗45±1286±08∗100±16∗170±19∗053(043，065)∗10±02∗52(100)T2DM组6537/28382±4747±1278±07∗90±12138±08∗187(165，216)∗60±15∗0 NC组8348/35368±47-51±04∗51±07∗61±11∗148(125，179)∗56±19∗0 检验统计量值0245▲4134350819416729210807985843204547△262050-P值08890000044300000000000000000000-

注：▲为χ2值，△为Z值；HbA1c=糖化血红蛋白，FPG=空腹血糖，2 hPG=餐后2 h血糖，FCP=空腹C肽，2 hCP=餐后2 hC肽；GADA=谷氨酸脱羧酶抗体；与LADA组比较，*P<0.05；-表示不存在

表3 LADA患者GPLD1与相关因素的Spearman相关分析

LADA是一种自身免疫性糖尿病[15]，本研究发现GPLD1在LADA组和T1DM组中的表达均增高，这与之前相关报道相吻合[7,13]。本研究相关性分析显示，血浆GPLD1水平与FCP呈负相关，与FPG、2 hPG、HbA1c呈正相关。FCP水平下降意味着胰岛β细胞功能的损害及自身分泌胰岛素水平的下降，而上述国外研究表明胰岛β细胞功能的自身免疫性破坏可能与血浆GPLD1水平升高有关[12,14]。这就意味着GPLD1升高时胰岛β细胞功能是下降的，使血糖的控制受到影响，导致FPG、2 hPG、HbA1c等反映即时和近期血糖控制情况的指标升高。本研究多因素回归分析进一步证实了FCP是影响血浆GPLD1水平的主要因素。这与之前国外研究中对血浆GPLD1水平与自身免疫性糖尿病关系的诸多推测相吻合。

至于GPLD1是如何影响胰岛β细胞功能的，可以从GPLD1本身的功能出发做一推测。GPLD1本质上是一种水解酶，其主要作用于酯键，特别是可以对磷二脂进行水解，具体而言就是从GPI锚的脂质部分劈开蛋白质，使与GPI锚相连的蛋白质脱落下来。目前已有研究表明GPLD1能从多种细胞中水解和自发释放不同的锚蛋白，如：GPLD1断开GPI-锚蛋白连接，使血清碱性磷酸酶的水平受到影响[16-17]；GPLD1断开GPI-锚蛋白连接，使得与其相连接的癌胚抗原(CEA)从结直肠癌细胞表面释放[18]；GPLD1断开GPI-锚蛋白连接后产生肌醇磷酸多糖，后者作为第二信使诱发细胞反应，引起细胞因子、胰岛素和其他激素的改变[19]。因此，可以对GPLD1与LADA的关系做一大胆推测：GPLD1作为一种水解酶，能断开GPI-锚，而GPI-锚所连接的蛋白为内质网新合成的蛋白，这些蛋白的种类和功能各不相同，可以是酶、淋巴因子、激素，也可以是自身抗体、自身抗原；当GPLD1 活性增强时，其水解酶的作用充分发挥，将GPI-锚所连接的蛋白断开，这些不同种类和功能的蛋白随循环到达机体各处，从而对机体的代谢等生理功能造成不同的影响；脱落下来的蛋白若为自身抗原或者自身抗体则会引起机体免疫功能的紊乱，从而引发自身免疫性疾病，例如造成胰岛β细胞功能的自身免疫性破坏从而导致LADA。如果这一推测成立，那么GPLD1在血浆中的水平变化可以看做是LADA等自身免疫性疾病发生的始动环节，对疾病的早期预测将有重要意义。

本研究还绘制了ROC曲线，分析血浆GPLD1水平对LADA的早期诊断价值，结果发现GPLD1早期诊断LADA的AUC为0.623。依据0.5<曲线下面积≤0.7表示诊断价值一般[20]，故GPLD1尚不能作为诊断LADA的独立指标。但GPLD1是一种简单、可快速检测的指标，能够指导临床医生对那些有潜在LADA风险的患者给予高度关注。

总之，LADA患者血浆GPLD1水平是相对升高的，并且GPLD1在发病机制上与LADA关系密切。同时血浆GPLD1易于快速检测，费用不高，可为进一步临床研究奠定基础；在继续增加研究样本量和临床实践研究的基础上，血浆GPLD1有望成为早期诊断LADA的一个十分实用的指标。此外，进一步深入探讨GPLD1在LADA发生发展中的机制，可能为LADA的治疗提供新的突破点。

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