小麦干种子基因组DNA的提取及效果研究

王红梅，厚毅清，欧巧明

（甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃兰州 730070）

小麦干种子基因组DNA的提取及效果研究

王红梅，厚毅清，欧巧明

（甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃兰州 730070）

分别采用试剂盒和CTAB法提取小麦干种子基因组DNA，DNA样品经紫外光谱吸收、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增检测。结果表明，试剂盒提取DNA操作过程快速简便、成本较低，DNA产率和纯度优于CTAB法。通过多重PCR技术分别以小麦LMW-GS亚基Glu-B3位点和黑麦碱secalin-p基因的特异引物进行扩增，均能够扩增出清晰的目标条带，提取的基因组DNA能够满足分子检测的实验要求。

小麦；干种子；基因组DNA；提取效果

小麦是我国主要粮食作物之一，目前关于小麦分子生物学方面的研究日益深入，先进技术如基因克隆与转化、遗传图谱构建、特定基因型检测、分子标记辅助育种及DNA指纹数据库构建等在小麦育种中广泛应用［1～6］。高质量DNA的提取是在分子水平上对植物进行系统分析与研究的基础，关于植物基因组DNA提取的方法有很多［7～8］，但多数需要以植物新鲜组织为材料提取基因组，这就需要在植物生长季节取样或通过室内培养提供，并且需要液氮研磨，存在步骤多、耗时长等缺点。植物干种子在常温下可稳定保存，用种子提取DNA不受季节和形态的限制，具有极大的便利性［9～11］。我们以小麦干种子为实验材料，分别采用试剂盒和CTAB法提取基因组DNA，并对DNA产率、纯度和提取成本进行了对比分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦种子由甘肃省农业科学院小麦研究所提供。植物基因组DNA提取试剂盒DP305和DNA Marker Ⅴ购自北京天根生化科技有限公司，PCR扩增引物由invitrogen北京生物科技有限公司合成，Taq DNA聚合酶、RNA酶、dNTP等生化试剂均购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司，CTAB、Tris-Cl、EDTA-Na2、酚-氯仿等化学试剂均为分析纯。

超低温冰箱为SANYO ULTRA LOW MDF-382E，电子天平为Explorer OHAUS公司生产的万分之一分析天平，台式高速离心机型号为Heraeus D-37520，PCR仪为BIO-RAD T100TM。凝胶成像分析系统为BIO-RAD Gel DocTMXR+，电泳仪为DYY-III7B型，电热恒温水浴锅为HWS24，紫外可见分光光度计为Helios Alpha，微量移液器为Eppendorf等。

1.2 方法

1.2.1 小麦种子基因组DNA提取选取少量小麦种子，用小块干净布包起来并用钳子夹碎，再用研钵研成粉末（或者采用微量种子破碎仪磨粉），将大约100 mg粉末转移到1.5 mL的离心管中，CTAB提取DNA参照魏琦超等的方法［12］，试剂盒提取方法参照DP305试剂盒使用说明书。每处理一个样彻底清理仪器，以免DNA样品之间的交叉污染。

1.2.2 DNA纯度和浓度的测定将2 μL DNA用双蒸水稀释至500 μL，用紫外分光光度计测定样品液在230、260、280 nm波长下的吸光值，并计算OD260/ OD230，OD260/ OD280的值。DNA样品的浓度（μg / μL）=OD260×稀释倍数×0.05。

1.2.3 DNA分子量大小及完整性的检测取2 μL DNA溶液、5 μL dd H2O和3 μL上样缓冲液混匀点样，以0.8%琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，在凝胶成像仪上进行观察并照相。用标准分子量Marker及Image lab 4.0软件估算DNA条带分子量大小。

1.2.4 PCR扩增检测根据1.2.2中测定的DNA浓度，将所有DNA样品的浓度稀释至50 ng /μL，取1 μL DNA稀释液作为模板，以小麦1BS上的LMW-GS亚基Glu-B3 基因和黑麦1RS上的secalin-p基因的特异引物进行扩增，反应体系为20 μL。PCR 扩增引物［13～14］和扩增条件见表1。反应结束后取10 μL扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，电压5～10 V/cm，电泳时间30 min。

表1 多重PCR扩增引物和扩增条件

2 结果与分析

2.1 DNA样品的产率和纯度

采用试剂盒可以从大约100 mg的小麦粉中提取DNA平均约7.5 μg，OD260/ 0D280比值在1.75～1.94，表明蛋白质、酚类等杂质去除干净，且无RNA污染，DNA样品产率高、纯度好。而用CTAB法从大约100 mg的小麦粉中提取DNA平均约2.8 μg，OD260/ 0D280比值比较分散，在1.6～2.3，大于2.0的样品有RNA污染，小于1.7的存在蛋白质、多糖等杂质。可见使用试剂盒提取的DNA在产量和纯度上都优于CTAB法。

2.2 改良CTAB法提取DNA的完整性

由图1可以看出，采用试剂盒和CTAB法提取的DNA电泳谱带单一整齐，证明2种方法都可以从小麦干种子中提取较为完整的总DNA，经Image lab 4.0软件估算分子量大小为50 kb左右，但提取效果存在明显差异。由试剂盒提取的DNA电泳条带整齐清晰，蛋白、RNA去除彻底，而CTAB法提取的DNA电泳条带弱，点样孔有少量蛋白质或多糖类物质残留，泳道有不同程度的拖尾现象，可能在提取过程中由于操作步骤繁琐、时间长，使DNA分子发生少量降解，同时存在少量的RNA污染。

图1 小麦种子中提取的基因组DNA电泳图谱

2.3 样品DNA多重PCR扩增结果

以小麦干种子提取的DNA为模板，及小麦Glu-B3位点和黑麦Sec-p基因的特异引物进行多重PCR扩增的结果（图2）表明，Glu-B3和Sec-p位点PCR扩增片段大小分别为630 bp和1 076 bp，与预期目标片段大小一致。由试剂盒提取的样品扩增产物亮度强，条带清晰，CTAB法提取的模板扩增效果较差。

图2 小麦Glu-B3、黑麦Sec-p位点PCR 扩增产物电泳图谱

2.4 成本比较

提取小麦干种子基因组DNA，采用试剂盒和CTAB法的实验成本相当。试剂盒价格虽然较高（100次样本价格为600元），但在2 d内即可轻松完成从磨样、DNA提取到琼脂糖凝胶电泳检测等工作，实验成本约7.2元/样品，效果好且省时又省力。CTAB法从小麦干种子提取DNA，100个样品从磨样到DNA提取纯化完成需5 d时间，人工加试剂费用，估算成本为8.0元/样品，比试剂盒提取成本稍高但效果不如试剂盒。

3 小结与讨论

1）采用试剂盒

从小麦干种子提取基因组DNA产率高、纯度好。100 mg样品提取DNA量平均为7.5 μg，OD260/ 0D280比值为1.75～1.94，DNA片段大小完整、不干扰酶活性等，能够满足分子检测、遗传标记等分子生物学实验。CTAB法DNA产率较低，存在蛋白质、多糖等杂质，有少量RNA污染，虽然对PCR扩增影响不大，但DNA量偏少，远不能满足酶切、基因位点多态性分析等实验需求，该提取方法有待进一步改良。

2）一般认为，试剂盒提取DNA的实验成本远高于常规的CTAB法。但我们多次实验证明，试剂盒的实验成本低于后者。以100个样本来估算，采用CTAB法从植物幼嫩叶片中提取DNA质量，从获得小麦实生苗、溶液配制与消毒、磨样到DNA提取纯化完成最少需要11 d时间，熟练实验工人工费以60元/d计，加上化学试剂及液氮等的费用，实验成本大于10元/样品（不包括水电费及仪器设备折旧费），工作量大、耗时而且成本不低。目前，随着劳动力市场人工工资的逐年上涨，人工费在所有实验成本中占相当大的比例，是导致实验成本不断上升的主要因素。

3）小麦干种子DNA在常温下不易降解，可方便在任何季节和环境下提取。试剂盒操作方法快速简便，但需要注意种子磨粉一定要充分呈细粉状，取样尽量不带麸皮；样品量控制在100～150 mg，若大于150 mg反而会降低DNA产量；65 ℃恒温水浴时间由30 min延长到1 h，每隔10 min轻轻颠倒离心管几次使提取缓冲液与样品充分混匀，注意操作细节可以大大提高DNA产率和纯度。

［1］何中虎，夏先春，陈新民，等.中国小麦育种进展与展望［J］.作物学报，2011，37（2）:202-215.

［2］董淑静，许为钢，胡琳，等.43个河南主推小麦品种抗条锈病基因的分子检测［J］.华北农学报，2012，27（5）：157-162.

［3］李景良，易玲，李林，等.青稞Hval-hv基因对小麦的遗传转化研究［J］.西南农业学报，2012，25（5）：1 558-1 562.

［4］杨燕，王晓丽，刘世鑫，等.利用STS标记检测我国小麦推广品种的抗穗发芽基因型［J］.华北农学报，2013，28（3）：183-188.

［5］邵宏波，梁宗锁，邵明安.小麦抗旱生理生化和分子生物学研究进展与趋势［J］.草业学报，2006，15（3）：5-17.

［6］魏亦勤，李红霞，叶兴国，等.外源抗病基因导入小麦的应用研究［J］.甘肃农业科技，2002（3）：10-13.

［7］张志清，郑有良，王丕武，等.微量法提取高质量小麦DNA供大规模PCR分析［J］.西北农业学报，2005，14（6）：83-86.

［8］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.GB/T 19495.3—2004转基因产品检测核酸提取纯化方法［S］.北京：中国标准出版社，2007.

［9］张泽华，刘萌娟，张敏娟，等.一种用干种子快速提取基因组DNA的方法［J］.干旱地区农业研究，2007，11（25）：35-37.

［10］张富丽，刘勇，宋君，等.一种DNA提取新方法在转基因水稻种子检测中的应用［J］.湖北农业科学，2012，51（10）：2 118-2 121.

［11］ZHANG F L，LIU Y，SONG J，et al.A method for rapid salt-extraction of high-quality genomic DNA from plant seeds［J］.Agricultural Science＆Technology-Hunan，2012，13（3）：485-488.

［12］魏琦超，畅丽萍，周岩，等.利用改良CTAB法提取小麦干种子总DNA［J］.山西农业科学，2009，37（6）：30-32.

［13］CHAI J F，ZHOU R H，JIA J Z，et al.Development and application of a new codominant PCR marker for detecting 1BL/1R wheat-rye chromosome translocations［J］.Plant Breeding，2006，125:302-304.

［14］VAN CAMPENHOUT S，VANDER STAPPEN J，SAGI L，et al.Locus specific primers for LMW glutenin genes on each ofthe group I chromosomes ofhexaploid wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，1995，91：313-319.

（本文责编：王建连）

Study on the DNA Extraction Effects from Dry Seeds of Wheat

WANG Hong-mei，HOU Yi-qing，OU Qiao-ming
（Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

Two rapid DNA isolation methods from dry seeds of wheat was established by DNA extraction kit and CTAB in this study. The DNA samples were detected in terms of the UV spectrophotometer analysis，agarose gel electrophoresis，PCR amplification respectively. The results indicats that the method with DNA Extraction Kits was simple，rapid and low costs，the extraction rate and purity of DNA was better than that of the CTAB. Using the DNA samples as template，the Glu-B3 locus of wheat LMW-GS and ω-secalin gene of triticale could be amplified with distinct and specific target bands by multiplex PCR. The genomic DNA extracted from dry seeds of wheat can meet the needs of molecular tests.

Wheat；Dry seeds；Genomic DNA；Extraction effects

S512.1；Q781

A

1001-1463（2014）10-0013-03

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.10.005

2014-07-08

甘肃省农业科学院农业科技创新专项“甘肃小麦品种资源1BL/1RS易位系的分子标记检测研究”（2012GAAS06-4）、甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目“持久条锈病抗源BJ144抗锈基因发掘及抗锈小麦新品系的培育”（GNSW-2011-07）、甘肃省科技支撑计划项目“小麦5B染色体基因组抗锈基因关联分析及抗锈新品系培育”（1304NKCA142）部分内容

王红梅（1972—），女，甘肃灵台人，助理研究员，主要从事农业生物技术应用研究。联系电话：（0）13893659623。E-mail：676640934@qq.com