Survivin和PLK1在急性白血病中的表达及临床意义

于广晴，赵田华，倪 蕾，张小霞，赵悦荣

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

急性白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞大量增殖并抑制正常造血。该病发展快、预后差，病死率高。目前对其发病机制尚未完全清楚。其治疗方法仍主要以化疗、骨髓移植为主，其副作用大，同时患者生存质量差，故我们积极探讨其发病原因的同时，迫切需要寻找一种能够靶向治疗急性白血病的方法，尽可能减少传统化疗方法的严重不良反应。目前有关实体肿瘤靶向治疗的新靶点的报道层出不穷，但是白血病治疗靶点相关报道甚少。据有关文献报道其机制为在AL中Survivin蛋白可能是PLK1的靶基因之一，两者可能发挥协同作用，相互促进肿瘤的发生发展[1]。

肿瘤是机体细胞在多种致瘤因素作用下产生的增生、分化异常的新生物。其主要表现为生长失控、凋亡受阻。近年有关报道指出，在这一系列复杂的过程当中需要多种细胞组份参与，PLK1和Survivn就是这众多组份中起关键作用的蛋白，它们的生物学功能与实体肿瘤的发生及恶性进展关系密切[2，3]。本实验在于研究急性白血病患者骨髓细胞中PLK1和Survivn蛋白的表达水平及二者相关性，探讨它们在临床治疗急性白血病中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 病例来源

随机动态选取佳木斯大学附属第一医院2011-10～2013-12期间54例初治AL患者骨髓细胞样本，其中男32例，女22例；年龄10～75岁，中位年龄35岁。留取初治组完全缓解后标本,其中ALL-CR组19例,AML-CR组11例。选取佳木斯大学附属第一医院2011-10～2013-12体检其他方面均正常，既往身体健康，无其他系统疾病人群19例作为对照组，其中男9例，女10例，年龄22～69岁，中位年龄45.5岁。

1.2 标本处理

取骨髓1mL，抗凝处理，加淋巴细胞分离液适量，离心，吸取单个核细胞调整细胞数量涂片制备好标本玻片，用保鲜膜包裹密封后装盒,-20℃冰箱保存备用。

1.3 方法及主要试剂

采用免疫细胞化学方法检测PLK1和Survivin表达情况实验所用试剂为SP-9002免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型鼠抗人PLK1单克隆抗体(0.2mL)购于上海长岛生物技术有限公司。浓缩型鼠抗人Survivin单克隆抗体(0.lmL)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 判定结果

PLK1和Survivin阳性细胞以细胞膜和(或) 细胞质呈现浅黄或棕褐色颗粒计为染色阳性。显微镜下计数500个细胞(参考中性粒细胞碱性磷酸酶结果判断方法),按照染色强度和染色细胞百分数进行评分，其中A(染色强度)评分标准即：0分为无色、1分为浅黄色、2分为综黄色、3分为棕褐色；B(染色细胞百分数)评分标准即：≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、≥51%为3分；A×B结果：0～1分、≥2分、2～3分、≥4分别为阴性(-)、弱阳性、中阳性(+)、强阳性(++)。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件处理,采用卡方检验对表达积分阳性率进行显著性分析,相关性分析应用Spearman进行,以α=0.05为检验水平。

2 结果

2.1 各组PLK1和Survivin表达水平

PLK1和Survivin在AML和ALL初治组患者骨髓细胞中的表达水平均显著高于正常完全缓解组和正常对照组，差异具有显著意义(P<0.05)；PLK1高表达组CR率低于低表达组,Survivin高表达组CR率低于低表达组,差异有显著性(P<0.05)。说明PLK1和Survivin得过表达对急性白血病的发生和恶性进程可能产生了不同程度地影响，可作为急性白血病临床预后判断的检测指标。见表1～2。

2.2 PLK1和Survivin表达水平相关性

初治急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞中PLK1的表达阳性率为66.7%，Survivin的表达阳性率为55.6%，PLK1的表达与Survivin的表达在AL中呈正相关(r=0.515,P<0.05)。见表3。

表1 PLK1在初治AL各组骨髓单个核细胞中的表达

*与正常对照比较，P<0.05;*与完全缓解组比较，P<0.05。

表2 Survivin在初治AL各组骨髓单个核细胞中的表达

*与正常对照比较，P<0.05;*与完全缓解组比较，P<0.05。

表3 初治AL中Survivin与PLK1蛋白表达的相关性

3 讨论

3.1 PLK1在急性白血病骨髓细胞中的表达及意义

PLK1(polo-like kinase-1)它属于Polo样激酶家族PLKs(polo-like kinase)的一员，由瑞士实验室肿瘤研究所的Golsteyn等在1994年最先报道[4]。生物化学和细胞生物学研究提示，Plk1 是细胞周期相关事件的重要调节因子，参与到细胞有丝分裂、细胞凋亡、细胞周期检验等过程，所有这些生物学功能均与肿瘤的发生、发展关系密切。

我们的实验结果提示PLK1在初治组AL患者骨髓单个细胞中表达增高，其细胞膜和(或)细胞浆的阳性表达率为66.7%，PLK1在髓系和淋巴系的表达均较正常对照组明显增高(阳性率分别为：63.6%、71.4%、5.3%),差异存在显著统计学意义(P<0.05)。我们的实验结果还显示,PLK1在初治AL中的表达与完全缓解后(CR)后的表达(阳性率分别为66.7%、13.3%)相比,其差异有统计学意义(P<0.05),而且初治AML与AML-CR(阳性率分别为63.6%、5.3%)相比，初治ALL与ALL-CR(阳性率分别为71.4%、27.3%)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。PLK1高表达组的完全缓解(CR)率低于PLK1低表达组的完全缓解(CR)率，分别为35.6%、67.6%,其差异有统计学意义(P<0.05)。我们的实验结果与国外有关报道显示出了相同结果[3]。故PLK1有可能作为急性白血病诊断、治疗和预后的指标应用于临床，并成为急性白血病的治疗新的靶点。

3.2 Survivin在急性白血病骨髓细胞中的表达及意义

Survivin(生存素)是于1997年由耶鲁大学的Ambrosini G等应用效应细胞蛋白酶受体-1cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来。其分子量为16.5KD。Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白( IAP)家族中结构独特的一个新成员，并且是分子量最小的IAP成员[5]。Survivin参与细胞周期调控的主要机制是与AuroraB和INCENP结合形成一个染色体通道蛋白复合体定位于着丝粒和中间体上进而调控细胞周期,它主要参与了纺锤体的组装以及细胞周期检测点的调控，同时肩负着对细胞凋亡过程的调控，最近更有报道指出 Survivin与新生血管形成关系密切。

我们的实验结果显示Survivin在初治急性白血病患者骨髓细胞中过度表达,其细胞膜和(或)细胞浆阳性率达到55.6%，Survivin在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病(阳性率分别为54.5%、57.1%)的表达较对照组(阳性率为10.5%)均有明显增高,差异有显著统计学意义(P<0.05),但Survivin在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病的表达相比,其差异不存在统计学意义(P>0.05)。实验结果进一步显示Survivin在初治急性白血病中的表达与完全缓解(CR)后的表达(阳性率分别为55.6%、10%),其差异存在显著统计学差异(P<0.05)；并且初治AML与AML-CR(阳性率分别为54.5%、5.3%)、初治ALL与ALL-CR(阳性率分别为57.1%、18.2%)之间均有统计学意义(P<0.05)。故我们有理由相信未来Survivin可作为临床诊断和治疗的指标。

本实验结果还显示,Survivin高表达组与低表达组相比其完全缓解(CR)率明显降低，分别为31.6%、68.6%,其差异存在统计学意义(P<0.05)。Kitada等发现,抗凋亡蛋白Survivin的高表达与低完全缓解(CR)率相关(P=0.05)[5]。本实验结果与该实验结果相似。这不禁使我们相信Survivin有希望作为临床预后判断指标被广泛推广。近几年Survivin在实体瘤中研究报道指出,Survivin的过度表达与肿瘤细胞的浸润及远处转移特性关系密切。

3.3 急性白血病骨髓细胞中PLK1和Survivin的关系及意义

肿瘤的发生和发展是复杂的细胞调控的过程，细胞周期的各个要素均参与这一过程中，综上所述，PLK1和Survivin蛋白参与细胞有丝分裂调节、凋亡调控、细胞周期检验等各各方面。我们的实验结果表明PLK1和Survivin的表达呈正相关，提示它们在AL的发生和发展过程中起协同作用，共同促进急性白血病的发生发展。

近年的研究表明，PLK1和Survivin亦可参与肿瘤新生血管的形成，并且在其发生、发展、侵袭、转移等过程中起到主要作用。故针对二者的生物学作用为靶点的新的治疗白血病的方法，有望为急性白血病治疗开辟新的思路，提供广阔的应用前景，值得进一步研究和探索。

[1]Toyoshima Morimoto F, Taniguchi E, Nishida E，et al.PLK1promotes nuclear translocation of human Cdc25C during prophase[J].Clin Cancer Res,2002,3(4):8-7

[2]Sunkel,CE，DM Glover，Polo, et al.A mitotic mutant of Drosophila displaying abnormal spindle poles[J].Cell Sci,1988,89 (10):25-38

[3]Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, et al.Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an “off-target” effect [J].Mini Rev Med Chem, 2007,96(12): 1035-1039

[4]Mori A,Wana H,Nishimura Y, et al.Expression of the apoptosis gene survivin in human leukemia[J].Int J Hematol, 2002, 75(2):161-165

[5]张纯，张淑萍，樊英丽，等.抗凋亡蛋白survivin在急性白血病细胞中的表达及临床意义[J].黑龙江医药科学，2003，26(6)：3-4