蜈蚣兰无菌繁殖系的建立

程 倩，陈梦竹，罗 丽，邵世光，唐 萍，郑 霞，沈 洁

（连云港师范高等专科学校 生命科学系,江苏 连云港 222000）

蜈蚣兰无菌繁殖系的建立

程 倩，陈梦竹，罗 丽，邵世光，唐 萍，郑 霞，沈 洁

（连云港师范高等专科学校 生命科学系,江苏 连云港 222000）

以蜈蚣兰茎段为外植体,以0.1%HgCl2溶液为外植体表面消毒剂,通过6,8,10和12 min等4个外植体表面消毒时间处理比较,研究对外植体污染率、死亡率和侧芽诱导率的影响,确定最佳消毒时间。结果表明,0.1%HgCl2溶液外植体表面消毒10 min效果最好,依此建立蜈蚣兰无菌繁殖系。

蜈蚣兰；外植体；表面消毒时间；无菌繁殖系

蜈蚣兰（Cleiso-stama scolopendrifolium（Makino）Garay）为兰科隔距兰属多年生常绿草本植物,附生于岩石或树皮上,是国家重点保护野生植物名录中的Ⅱ级保护植物。全草入药,有清热解毒、润肺止血之功效,用于气管炎、咳血、胆囊炎、咽喉炎等症［1］。因其分布区域窄、生境独特、种群小等原因,对其药理、药化方面的研究少有报道,其药用仅限于少数地区的民间,影响了该物种资源的开发和利用［2］。组织培养技术为珍稀药用植物种质资源的保存、开发开辟了新途径［3-6］。蜈蚣兰的离体快繁目前尚未见报道。本试验以蜈蚣兰的茎段为外植体,拟建立蜈蚣兰无菌繁殖体系,为蜈蚣兰的组织培养奠定基础。

1 材料与方法

l.l 材料

蜈蚣兰于2012年5月采自江苏省云台山,采集和鉴定均由连云港师范高等专科学校完成。以蜈蚣兰幼嫩植株为试验材料。

l.2 方法

1.2.1 外植体的处理和培养

将去除气生根的蜈蚣兰植株,用毛刷蘸洗涤剂进行表面刷洗,在自来水下冲净洗涤剂,至干净的烧杯中流水冲洗2 h后,移至超净工作台内进行表面消毒,以0.1%HgCl2溶液作为表面消毒剂。先将试验材料放入70%酒精中浸润30 s,然后迅速转入0.1%HgCl2溶液中浸泡消毒。试验设6,8, 10和12 min等4个消毒处理时间。表面消毒后,用无菌水冲洗5遍,每遍不少于3 min。试材表面水分用无菌纸吸干后,将其剪切成2～3 cm长的蜈蚣兰茎段,接种于1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+ 0.6%琼脂+2%蔗糖的培养基中 （pH值5.8）。每瓶培养基只接种1个外植体。每处理接种20瓶,重复3次。培养条件：温度 （25±2）℃,光照强度2 500 lx,光照时间12 h·d-1。每天观察记录外植体的生长状况。

1.2.2 数据分析

污染率/%=污染数/接种数×100,死亡率/%=死亡数/接种数×100（污染且死亡的统计在污染数里）,侧芽诱导率/%=侧芽萌动数/接种数×100。

2 结果与分析

接种2周内,每日观察外植体的生长状况,并记录外植体污染和死亡情况；2周后统计污染率和死亡率,培养50 d后统计外植体侧芽诱导率。

表1显示,随着外植体表面消毒时间的延长,外植体污染率明显降低,且10 m in的消毒时间处理效果显著,外植体的污染率由75%降至35%；但同时,外植体的死亡率随消毒时间的延长呈上升趋势,12 min消毒时间处理使得外植体死亡率高达46.7%。上述数据表明,0.1%HgCl2表面消毒效果良好,但超出一定消毒时间后,对外植体影响较大。在本试验中,0.1%HgCl2表面消毒10 min效果最好。

表1 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响

从表2可知,12 min消毒时间处理的外植体侧芽诱导率最低,仅13.3%,且外植体叶片泛黄,甚至脱落。8 m in处理的外植体侧芽诱导率最高,达18.3%,然其外植体的生长状况却不及10 min消毒时间处理的外植体。

表2 不同消毒时间对外植体侧芽诱导的影响

获得蜈蚣兰无菌繁殖系见图1-2。

图1 外植体侧芽萌发

图2 蜈蚣兰无菌繁殖系

3 小结与讨论

利用组织培养的方法可实现蜈蚣兰的快速繁殖,为珍稀药用植物的保护和合理利用奠定基础。而无菌繁殖体系的建立是实现组培快繁的关键。在无菌繁殖体系建立过程中,选择外植体表面消毒剂和确立消毒时间是首要环节。试验选用 0.1% HgCl2溶液作为外植体唯一表面消毒剂的原因有2个。一是其消毒效果好。0.1%HgCl2溶液的Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合,使菌体蛋白变性、酶失活,从而有效清除附着在外植体表面的细菌及真菌。二是外植体形态特征较特殊,蜈蚣兰植株微小,茎匍匐,节间距短,气生根发达,这些特征都会影响消毒剂的消毒效果。试验中外植体表面消毒时间的确定是通过比较6,8,10和12 m in等4个外植体表面消毒时间处理的外植体污染率、死亡率和侧芽诱导率来完成的。结果表明,以 0.1% HgCl2为蜈蚣兰外植体表面消毒剂消毒10 min,不仅外植体消毒效果好,外植体侧芽萌发率高,且外植体生长健壮。由此成功获得蜈蚣兰无菌繁殖系。而此物种的组培研究之前尚未见报道。

本试验中共设立了4个消毒时间处理,接种240个蜈蚣兰外植体。接种至50 d时,无1例细菌污染,出现的均为真菌污染,且污染瓶中菌丝相同。初步判断为蜈蚣兰内生菌,现菌种已被分离纯化,鉴定后将另外发表。因菌丝生长迅速,严重影响了试验的进程,在以后的蜈蚣兰组培试验中,将重点寻求适宜的控制蜈蚣兰内生菌生长的方法。另试验中,240个外植体接种的培养基配方一致,均为1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+0.6%琼脂+2%蔗糖,侧芽诱导培养基、增殖培养基以及壮苗生根培养基的配方还有待进一步优化,以筛选出最佳培养基。

［1］ 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编 （下）［G］.北京：人民卫生出版社,1978：656.

［2］ 张雷,马波,邵世光.蜈蚣兰药用价值及生态学特性研究［J］.安徽农业科学,2011,39（26）：15960-15961.

［3］ 李春斌,方宏筠,王光林.药用植物莪术的组织培养快速繁殖与植株再生的研究 ［J］.中草药,2000,31（11）：853-856.

［4］ 范俊安,王继生,张艳,等.铁皮石斛组培品与野生品的形态组织学和多糖含量比较研究 ［J］.中国中药杂志, 2005,30（21）：1648-1650.

［5］ 戴传超,余伯阳,董晨,等.药用植物大戟的快速繁殖研究 ［J］.广西植物,2005,25（2）：152-155.

［6］ 张延红,何春雨,刘晓博,等.甘肃道地黄芪种苗的离体快繁研究 ［J］.中草药,2008,39（11）：1729-1732.

（责任编辑：张瑞麟）

S 682

：B

：0528-9017（2014）04-0515-02

文献著录格式：程倩,陈梦竹,罗丽,等.蜈蚣兰无菌繁殖系的建立 ［J］.浙江农业科学,2014（4）：515-516.

2013-12-06

江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目 （2012JSSPITP4290）

程 倩 （1990-）,女,江苏徐州人,生物制药专业专科学生。

沈 洁 （1969-）,女,江苏靖江人,理学硕士,教授,从事植物细胞结构与分子生物学教学与研究工作。E-mail：shenjie1969 @126.com。