黄珊,高文祥,高钰琪
(1蚌埠医学院病理生理学教研室,安徽蚌埠 233030;2第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原生理学教研室,全军高原医学重点实验室,高原医学教育部重点实验室,重庆 400038)
线粒体DNA稳定性与疾病的关系*
黄珊1,高文祥2△,高钰琪2
(1蚌埠医学院病理生理学教研室,安徽蚌埠 233030;2第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原生理学教研室,全军高原医学重点实验室,高原医学教育部重点实验室,重庆 400038)
线粒体;线粒体DNA;稳定性
线粒体是真核细胞内进行氧化磷酸化和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成的细胞器,为细胞活动提供能量,有“细胞动力工厂”之称。此外,线粒体还是细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要场所,并能启动和执行细胞的凋亡[1]。线粒体由核基因和线粒体基因组共同编码,其DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)和(或)核DNA (nuclear DNA,nDNA)的遗传缺陷均可引起线粒体功能障碍而导致疾病发生。
1 线粒体DNA
mtDNA为一环状双链DNA分子,由位于外侧的重链(H)和位于内侧的轻链(L)组成。人的mtDNA 长16 569 kb,编码13个氧化磷酸化相关的多肽、22 个tRNA和2个rRNA。与nDNA相比,mtDNA在结构和功能上有其独特的特点:(1)线粒体是半自主细胞器。绝大部分构成线粒体的蛋白以及mtDNA复制、重组、转录等过程所需的酶均由nDNA编码,而mtDNA基因的复制、转录和翻译则受nDNA调控。(2)每个细胞平均有100~1 000个线粒体,每个线粒体内又有多个mtDNA拷贝,因此同一个体可以同时存在2种或2种以上类型的mtDNA,即线粒体的异质性。突变型mtDNA是否在组织产生表型效应,与突变型mtDNA与野生型mtDNA的相对比例和组织的能量消耗程度有关。(3)mtDNA存在多态现象,2个无关个体的mtDNA碱基平均相差3%。mtDNA异质性和多态性与疾病的关系受到越来越多的关注。(4)mtDNA基因排列紧凑,除与其复制及转录有关的一小段区域外,内含子序列极少,因此其DNA序列利用效率高。一旦mtDNA发生突变,往往容易累及其基因组的一些重要功能区域,导致严重后果。(5)mtDNA悬挂在线粒体内膜上,与氧化磷酸化和活性氧生成的主要场所相距较近,极易受到活性氧和自由基攻击。同时,mtDNA复制错误率高且修复机制不完善,部分突变还具有叠加效应。
2 mtDNA稳定性调节
mtDNA稳定性受多种因素影响,不稳定的mtDNA可能来自mtDNA本身或继发于nDNA异常,这种异常在mtDNA的复制和转录、损伤和修复以及线粒体动力学上都有所体现。
2.1 mtDNA复制和转录正确有效的复制是维持mtDNA稳定性的先决条件。mtDNA复制通常采用两条链非同步复制的链置换模型,复制速度快,且可以连续进行。mtDNA也可通过与nDNA类似的双链配对模型,此时细胞mtDNA可出现暂时性减少。
研究证实与mtDNA复制机制有关的因子均为nDNA编码蛋白,其功能障碍可影响mtDNA复制,导致mtDNA突变或含量降低。γ聚合酶是mtDNA复制的关键因子,其催化亚基(mitochondrial DNA polymerase gamma 1,POLG1)突变可导致错误核苷酸掺入mtDNA,引起呼吸链功能障碍,是人类线粒体疾病的一个重要原因。线粒体内的脱氧核糖核苷三磷酸池(deoxyribonucleotide triphosphate pool,dNTP池)对于复制的保真度有重要作用。其中线粒体dNTP池调节因子,如线粒体脱氧核糖核苷酶可能在调节mtDNA复制中发挥重要作用。
mtDNA复制的起始需要由轻链启动子起始转录一小段RNA作为引物,因此正常的转录机制是mtDNA正常复制的先决条件。线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,mtFFA)和线粒体转录因子B(mitochondrial transcription factor B,mtFFB)是重要的mtDNA转录因子,如无转录因子存在,mtRNA聚合酶则不能识别线粒体转录启动子,而仅有极弱的非特异性转录活性。资料显示这2种因子是哺乳动物线粒体类核的主要组成部分,可以调节线粒体转录和复制,且在维持mtDNA拷贝数和线粒体形态中起重要作用。mtFFA基因敲除的纯合子小鼠在胚胎期即可死亡,杂合子小鼠则表现为mtDNA拷贝数减少和心脏线粒体呼吸功能障碍[2]。若抑制多巴胺能神经元中mtFFA的表达还可引起mtDNA含量降低和线粒体呼吸功能严重障碍而导致多巴胺细胞死亡从而引起神经退行性病变[3]。
2.2 mtDNA损伤与修复mtDNA损伤修复与细胞凋亡、衰老关系十分密切。自Hunter和Haworth发现线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)存在后,目前认为mPTP的高通透状态与细胞的死亡有关[4]。该通道主要的2个组成分别是位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转运体(adenine nucleotide transporter,ANT)和位于线粒体外膜的线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC),这两者的开放状态都与mtDNA的突变损伤有关,其中VDAC的开放状态还对维持线粒体膜电势和线粒体内钙[Ca2+]非常重要。另一方面,线粒体是细胞内ROS产生的主要场所,mtDNA持续暴露在线粒体ROS和自由基中,极易发生氧化修饰和mtDNA突变,因此需要有效的修复系统来维持线粒体基因组的完整与稳定。
以往认为mtDNA缺乏修复机制,近来研究发现,mtDNA可通过碱基切除修复和核苷酸切除修复2个主要途径进行修复。碱基切除修复途径是主要的DNA修复机制,通过DNA糖基化酶裂解碱基与DNA糖-磷酸骨架之间的糖苷键,切除损伤的碱基[5],可修复氧化损伤、烷基化、脱氨、位点的缺失和单链断裂等DNA损伤。核苷酸切除修复途径则通过核酸酶消耗ATP,切除损伤的核苷酸碱基,可识别和处理各种螺旋扭曲病变,如紫外线引起的光化环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶6-4嘧啶酮光产物,还可修复较大的或其它修复系统不易修复的DNA损伤。
另外,mtDNA复制和修复还依赖于dNTP池的平衡[6],因此mtDNA的稳定性受到dNTP代谢过程影响。ANT是心肌线粒体内膜上含量最丰富和最主要的信号转导蛋白。已知人类ANT蛋白存在4个异构体,它们以组织特异性的方式在不同的位置表达,其与人类线粒体疾病相似。ANT1基因敲除小鼠出现线粒体脑肌病,H2O2生成增加,mtDNA损伤且含量降低,线粒体氧化磷酸化功能降低,可能由于线粒体ANT1缺乏时ROS生成增多而加重mtDNA损伤。而电流假说则认为突变的ANT1从线粒体内膜脱离,可能导致mtDNA损伤并含量降低。
2.3 线粒体动力学异常线粒体是一种处于高度运动状态的细胞器,频繁出现分裂和融合,这种过程被称为线粒体动力学。因此线粒体的形态结构并不是固定不变的,其分裂和融合的平衡对于线粒体形态维持以及能量代谢、细胞凋亡、信号转导等功能实现有重要意义。当线粒体动力学改变以及mtDNA损伤或突变时,可通过与健康线粒体融合,进行重组和修复。各种原因造成的线粒体融合-分裂失衡,均可导致细胞凋亡、mtDNA减少、突变和线粒体呼吸功能严重障碍[7]。
线粒体的融合装置是一个约800 kD的大型蛋白复合物,主要由线粒体融合蛋白(mitofusin,Mfn)和视神经萎缩1型蛋白(optic atrophy type 1,OPA1)组成。OPA1存在于线粒体内膜,是一个含有960个氨基酸残基的蛋白质,属于一个高度保守的GTP酶相关的动力家族。OPA1的GTP酶活性的降低可能通过影响线粒体dNTP池而影响mtDNA稳定性,其含量减少可导致线粒体组织结构异常、线粒体呼吸功能降低、mtDNA缺失以及ROS生成增加。Mfn1和Mfn2是存在于线粒体外膜的蛋白质,每个蛋白由1个大的GTP酶域和2个七肽重复序列组成。它们的基因突变或表达抑制可导致线粒体呈碎片状改变,呼吸功能障碍,mtDNA大量缺失,表明线粒体融合-分裂过程参与维持mtDNA稳定[8]。另外,Mfn2突变或表达降低还可延缓氧化损伤后mtDNA的修复过程。
3 线粒体DNA稳定性相关疾病
3.1 视神经病变OPA1在视网膜中表达量非常丰富,其基因突变可以导致线粒体脑肌病综合征,表现为感觉神经性耳聋、共济失调、神经轴突的感觉运动多发性神经病变、慢性进行性眼外肌麻痹和常染色体显性遗传性视神经萎缩(autosomal dominant optic atrophy,ADOA)。ADOA1型是一个严重的线粒体视神经病变,其特点是视网膜神经节细胞自婴幼儿时期即开始不可逆损失,从而导致进行性视力下降甚至失明[9],对中国、日本、丹麦和波兰的家系调查均发现,OPA1基因杂合突变可能是ADOA发生的关键性致病因素。
Mfn2和ANT1突变也可能与视神经病变发生相关。Rouzier等[10]调查了一个婴幼儿期开始视神经萎缩的家族,其临床表现与ADOA“+”表型相关的OPA1突变类似,而且与一个新的Mfn2错义突变相关。该突变引起患者骨骼肌mtDNA大量缺失,可能参与了常染色体显性遗传形式的进行性眼外肌麻痹的发生与发展。
3.2 癌症多种类型癌症患者的癌变组织和非癌变组织出现mtDNA突变,提示mtDNA缺陷在癌症的发生、发展中具有重要作用。目前认为,POLG基因突变可导致mtDNA缺失及乳腺癌表型,POLG的CAG重复变异可增加未成年妇女患乳腺癌的风险,但POLG-CAG重复序列长度是否为乳腺癌的潜在危险因素还需要进行大样本量研究加以验证[11]。而在垂体腺瘤的研究中,mtDNA突变导致呼吸链复合体Ⅰ的突变却被证明具有抗肿瘤作用,这种呼吸链复合体Ⅰ的突变很有可能是肿瘤发生的个体修饰[12]。另外,大肠癌的发生可能与高频率的TFAM截短突变有关,表现为TFAM蛋白质水平降低和mtDNA耗竭[13]。
3.3 心肌病Chen等[7]报道,人类和大鼠心脏衰竭时OPA1降低,导致线粒体组织结构异常,mtDNA耗损,线粒体电子传递链复合物活性降低。线粒体呼吸功能障碍导致ROS产生增加,累积的ROS反过来又损伤电子传递链和mtDNA,形成恶性循环,提示OPA1突变诱导的mtDNA损失可能是心脏病进行性发展过程中线粒体功能障碍的关键环节。
最近的研究发现,心肌病和肌病的发生与ANT1突变有关。病人的肌肉组织中不能检测到ANT1表达,同时mtDNA含量降低,线粒体数量增多,异常线粒体大幅增加[14]。动物实验也证实,ANT1敲除小鼠出现扩张型心肌病,其发生可能与mtDNA损伤和细胞凋亡有关。
3.4 糖尿病肥胖者和2型糖尿病患者骨骼肌Mfn2表达减少,导致mtDNA缺失,线粒体数量和氧化磷酸化功能下降,进而降低肌肉和肝脏组织的胰岛素信号,诱导发生胰岛素抵抗。因此,Mfn2是胰岛素灵敏度调节和糖尿病药物开发的一个潜在目标[15]。另外,糖尿病患者视网膜mtDNA易受损,导致其转录功能障碍。TFAM是mtDNA的转录和复制的一个关键因子,可改善糖尿病患者线粒体的生物合成,减缓或防止糖尿病性视网膜病变的进展[16],其甲基化作用可能参与青少年胰岛素抵抗的发病机制[17]。
3.5 腓骨肌萎缩腓骨肌萎缩(peroneal muscular atrophy;又称Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一组临床和遗传异质性的神经肌肉疾病,目前超过30个基因已被报道与CMT有关,其中Mfn2基因点突变是CMT最常见的原因,可引起腓骨肌萎缩2A型疾病(CMT2A)亚型,它是一种常染色体显性遗传性神经病变,表现为感觉和运动神经元长轴突功能障碍所致的早期肢端症状,以及视神经萎缩、感音神经性耳聋、痉挛性截瘫、手指震颤、弓形足、脊柱侧弯或膝关节挛缩等,是轴突周围神经病变的缺陷形式[18]。
3.6 帕金森病帕金森病(Parkinson disease,PD)是黑质中多巴胺能神经元损伤造成的一种常见的神经退行性疾病,线粒体功能障碍累积在其发病机制中起重要作用。研究表明,PD患者黑质体细胞mtDNA存在缺失突变和(或)点突变。Balafkan等[19]发现POLG1基因的CAG重复数与某些人群中的帕金森病有关。POLG是唯一参与mtDNA复制和修复的多聚酶,鉴于POLG1基因突变诱导的点突变积累和mtDNA缺失参与了多种疾病发生,因此POLG1基因突变可能也参与了PD继发性mtDNA突变积累。Gui等[20]也认为POLG1基因多态性可能参与了中国人群PD的发生,是PD易感性的理想候选基因。
3.7 脑神经疾病线粒体神经胃肠脑病(mitochondrial neurogastrointestinal encephalopathy,MNGIE)是一种常染色体隐性遗传疾病,部分MNGIE患者的肌肉活检发现呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ酶活性下降、mtDNA耗损、缺失、线粒体形态异常和肝性脑病,表明mtDNA不稳定可能参与了MNGIE的发生。由于MNGIE与PD都伴有中枢神经系统症状,都有线粒体结构和功能异常,并且其遗传基础可能也是POLG1突变,因此两者在发病机制上有很多共同点。不同的是MNGIE是由于遗传基因的缺陷导致的线粒体结构和功能异常,多发生于儿童和青年,而PD是由于神经系统变性而引起的纹状体多巴胺含量显著减少而致病的,老年人多见。Roshal等[21]则认为POLG1的A467T/W748S基因型可能出现广泛的神经系统表现,包括顶枕叶癫痫、偏头痛、小脑性共济失调、感觉运动性轴索型神经病、视觉及感知和认知功能的降低等。
4 结语
mtDNA稳定性、线粒体功能和ROS生成互为因果,常是多种疾病发生的重要病理生理基础。而nDNA编码了绝大多数的线粒体蛋白和全部的mtDNA复制、转录、修复等调节因子,相关的基因突变都可能影响mtDNA稳定性而导致疾病的发生。虽然已知上述调节因子可以影响mtDNA稳定性,从而在疾病的发生中起着重要作用,但其机制尚待进一步研究。
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Stability of mitochondrial DNA and related diseases
HUANG Shan1,GAO Wen-xiang2,GAO Yu-qi2
(1Department of Pathophysiology,Bengbu Medical College,Bengbu 233030,China;2Department of Highland Physiology and Pathophysiology,Faculty of Highland Military Medicine,Key Laboratory of High Altitude Medicine of PLA,Key Laboratory of High Altitude Medicine for Ministry of Education,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.E-mail:winneygaocn@yahoo.com.cn)
Mitochondrion is a semiautonomous organelle,which processes its own genetic material mitochondrial DNA(mtDNA).The stability of mtDNA can be affected by several factors,for example,replication,transcription and translation of mtDNA,mitochondrial fission and fusion.It has been recently found that mtDNA stability-related factors,such as optic atrophy 1(OPA1),mitofusin 2(MFN2),aromatic and neutral transporter 1(ANT1),mitochondrial DNA polymerase gamma 1(POLG1)and mitochondrial transcription factor A(TFAM),are important for maintenance of mitochondrial function.The stability of mtDNA can be impaired and diseases may occur due to malfunction of the above factors.In this article,we review the study progresses in the regulation of mtDNA stability and its related diseases.
Mitochondria;Mitochondrial DNA;Stability
1000-4718(2014)02-0369-05
R363
A
10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.033
2013-09-10
2013-12-05
国家自然科学基金资助项目(No.NSFC81071610);重庆自然科学基金资助项目(No.CSTC,2010BB5035)
△通讯作者Tel:023-68752335-8208;E-mail:winneygaocn@yahoo.com.cn