2013年国内外蜂产品质量安全研究进展

周金慧 郭伟华 李熠 吴黎明 薛晓锋 张金振 陈芳 陈兰珍 王鹏 黄京平 金玥 赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

2013年国内外蜂产品质量安全研究进展

周金慧 郭伟华 李熠 吴黎明 薛晓锋 张金振 陈芳 陈兰珍 王鹏 黄京平 金玥 赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

本文总结了2013年国内外蜂产品质量安全研究的概况和进展，分析了国内外文献的数据库分布和研究领域分布情况。以实际的研究内容展现了蜂产品质量安全研究的最新进展，包括农兽药的多残留检测、新颖的样品前处理方法、多种金属元素的同时分析以及利用不同的分析工具分析蜂产品中的内源性活性组分。这些研究对于拓展我国蜂产品质量安全研究提供了思路，为提升蜂产品检测方法的准确度和灵敏性和时效性起着积极的促进作用。

蜂产品，多残留分析，真实性分析，金属元素，活性组分

2013 年与蜂产品质量安全相关的研究主要涉及农药和兽药的残留检测分析、活性组分分析，金属元素分析和溯源分析。其中农药和兽药残留检测分析主要集中于多残留检测方法的建立，如数十种兽药和数百种农药的分析，还涉及利用先进的前处理方法提取蜂产品中残留的污染物；活性组分分析主要集中于糖类物质和易挥发组分,如酚酸和酚醛的研究；金属元素分析主要是常量和痕量元素的研究，而溯源分析侧重于利用不同的仪器分析方法对蜜源植物种类和掺假鉴别进行研究。本文对2013年国内外与蜂产品质量安全相关的文献进行分析，进而探索不同种类的蜂产品检测方法的研究思路。

1 文献分布情况

2013 年度截止至12月初，根据从美国汤姆森科技信息集团（web of science）、Google Scholar，Sciencedirect、Springerlink、EBSCO、美国分析化学协会（ACS）、英国分析化学协会（RSC）和Wiley等数据库搜索结果显示，2013年大约有133篇被SCI期刊收录的与蜂产品质量安全相关的英文文献，涉及蜂蜜的有102篇、蜂王浆5篇、蜂胶21篇和蜂花粉5篇。

从中国知网、维普网、万方数据知识服务平台和国家知识产权局检索数据库的数据显示，2013年与蜂产品质量安全相关的中文学术文献约为111篇，涉及蜂蜜的有54篇、蜂王浆11篇、蜂胶35篇、蜂蜡1篇，蜂花粉10篇，主要涉及蜂产品中的兽药和农药残留，重金属以及溯源分析。

2 研究进展

2.1 兽药残留分析

免疫传感器技术已经被用来分析蜂蜜样品中抗生素残留。Valera E[1]利用基于标记CdS纳米粒子的特异性抗体的免疫传感器分析蜂蜜中磺胺类抗生素药物残留。免疫传感器使用免疫试剂专门用来广泛识别磺胺类药物，一个石墨复合电极，生物功能性的磁性粒子和通过在特异性抗体标记CdS纳米粒子来实现的电化学纳米探针。免疫反应后，CdS纳米粒子溶解，释放的金属离子在电极被还原并且被阳极剥离技术以电流或电荷信号读出。由于CdS纳米粒子产生的安培型信号的放大作用使其能达到高的检测能力。因此，在缓冲溶液内可检测到磺胺嘧啶浓度为0.20±0.25μg/L。磁性粒子的使用将基质效应最大程度的降低，并且检出限达到0.11μg/kg，远低于一些国家分析蜂蜜中此类化合物的检出限。磁性分离架的使用能够同时分析多个样品，整个分析过程约在22min内完成。激光二极管热解析-大气压化学电离-串联质谱法也可以快速分析蜂蜜中氯霉素。

激光二极管热解析是一种与液相色谱完全不同的分析技术。将2～10μL的样品注入到96孔板中。每一个孔底部植入一块金属。将该盘室温干燥。用激光二极管加热孔，使干燥的样品迅速产生热解析。完整的热解析分子被载气带入到大气压化学电离区域进行离子化。大气压化学电离不需要溶剂或流动相就可以完成，这改变了离子化的特征，可以分析那些在普通大气压化学电离不能有效离子化的化合物。基于激光二极管热解析(LDTD)和大气压化学电离串联质谱(APCI-MS/MS)是一种高通量，快速，可靠的用来定性和定量分析蜂蜜中氯霉素残留的方法。与传统的色谱法分析需要几分钟相比，本方法全部分析时间小于6秒，本研究证明了LDTD-APCI-MS/MS能被用来快速有效地定量分析蜂蜜中的氯霉素残留[2]。

搅拌棒吸附萃取是一种新型的固相微萃取样品前处理技术,具有固定相体积大、萃取容量高、无需外加搅拌子、可避免竞争性吸附、能在自身搅拌的同时实现萃取富集等优点，广泛应用于食品、环境和生物样品分析的前处理。其主要原理是在磁力搅拌器上放置一个特殊的磁力搅拌棒，搅拌棒表面带有一个聚二甲基硅烷（PDMS）涂层，可以很有效地从水基质中萃取有机组分。搅拌棒吸附萃取技术结合液相色谱-电喷雾-串联质谱技术可以灵敏地检测蜂蜜中青霉素。采用一种方便灵敏的方法检测蜂蜜中六种青霉素（阿莫西林、氨苄青霉素、盘尼西林、苯唑青霉素、氯唑西林和双唑青霉素）。蜂蜜样品用水稀释，然后基于聚合（乙烯基咪唑、二乙烯苯）单片电路材料作为涂层直接搅拌棒吸附萃取处理。对萃取参数包括萃取和解析时间，pH值，离子强度在基质中进行了详细的研究。在最优提取条件下，估算的目标物检测限低至蜂蜜中0.18～1.42 ng/kg。本方法成功的应用到蜂蜜中青霉素残留分析中[3]。

多残留检测技术是近年来兽药和农药研究的热点。王伟等[4]建立了同时测定蜂蜜中60种兽药残留的LC-MS/MS检测方法。蜂蜜样品采用Mcllvaine缓冲溶液(pH＝4)稀释，5%乙酸乙腈提取，提取液经盐析，NH2吸附剂分散固相萃取净化，LC-MS/MS动态多反应监控模式测定。对16个市售蜂蜜样品进行测定，其中5个样品中检出磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类等兽药残留。该方法具有一次处理样品，可同时测定60种兽药残留的特点，适合于蜂蜜中多类兽药的高通量筛查检测。

湍流色谱是一种直接进样预处理技术，采用5～10 mL/min的高流速，形成非线性的液流，加快待测物在吸附剂上的分布速度，使得大分子的生物基质成分与小分子药物得到良好分离。基于湍流流动的液相色谱法结合超高效液相色谱-轨道阱质谱也能够快速半自动分析蜂蜜中兽药残留[5]。建立一种采用湍流流动的液相色谱法结合超高效液相色谱-轨道阱质谱 (TFC-UHPLC-Orbitrap-MS)简单快速地用于检测蜂蜜中40种兽药残留的方法。样品用含有Na2EDTA的水溶液稀释。然后注入到配备有湍流流动柱的液相色谱仪，之后分析物转移到配备有轨道阱质谱检测器的超高效液相色谱分析柱中。对于大多数化合物，在三个浓度条件水平的平均回收率范围是68~121%。该方法快速，省力并可应用到蜂蜜样品分析中。

分散液相微萃取是最近发展起来的一种新型样品前处理技术，该方法操作简单、成本低、富集效率高、所需有机溶剂用量极少，是一种环境友好的液相微萃取新技术。通过建立固相萃取和分散液液微萃取 (SPEDLLME)结合的方法可以检测蜂蜜中的新烟碱类杀虫剂[6]。固相萃取净化后，乙腈洗脱分析物。液液微萃取通过将乙腈提取液快速注入到含10% (w/v)NaCl和100μL CHCl3的水中来实现。离心后有机相蒸干，乙腈复溶，用二极管阵列-液相色谱上机检测。二极管阵列检测器 (DAD)和大气压化学电离-离子阱-串联质谱(APCI-IT-MS/MS)。基质效应通过使用二极管阵列检测器时外部水校准来评价和定量，基质匹配校准方法应用于MS/MS中。采用DAD和MS/MS方法分析新烟碱类杀虫剂，检测限分别可达到0.2～1.0和0.02～0.13 ng/ g。

分子印迹技术是指将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程。当模板分子（印迹分子）与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。一种新的印有氧氟沙星的分子印记预柱在线固相萃取技术结合反相高效液相色谱方法可以分析蜂蜜中喹诺酮类药物的残留检测[7]。分子印记整体柱在不锈钢色谱柱原位聚合制备，用甲基丙烯酸作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，氯仿和十二烷醇作为混和溶剂。研究了最佳的合成条件和在线固相萃取条件。分子印记整体柱通过斯卡查德分析和突破曲线分别得出最大的结合能力 (51.50 mg/g)和动态结合能力(434.92μg/mL)，高于非分子印记整体柱(43.15mg/g和96.52 μg/mL)。

烟曲霉素(Fumagillin)，又叫夫马洁林，是由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的发酵培养液中分离得到的一种抗生素。烟曲霉素作为防治微孢子虫病特效药在蜜蜂养殖中被广泛的应用,这必然导致其残留问题，而研究表明，烟曲霉素除具有抗生素活性外，还具有致癌作用并且可诱发遗传毒性[8]。烟曲霉素通过反相聚合物固相提取分离和浓缩。最终的提取液用电喷雾-液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）法在正模式下分析，甲酸和甲酸胺乙腈作为流动相，利用不同厂家的两种分析系统来测定方法的不确定性。LC/MS/MS法用来检测烟曲霉素经验证的总的回收率是99.3%，5.9%的精度，扩大的不确定度是13.2%。该法已经成功的应用到来自于加拿大食品检验局烟曲霉素检验项目部分的30个蜂蜜样品的检测中，同时也通过能力测试评估，对其进行粗略估计，并且证明该法是适合实际应用的[9]。

2.2 溯源分析

气相色谱-飞行时间质谱和顶空进样技术结合分析蜂蜜样品中的易挥发组分，通过寻找这些组分含量的差异进而判断蜂蜜的植物源和地理源特征，尤其是顶空固相微萃取-二维气相色谱-飞行时间质谱技术（SPME-GC×GC-TOF/MS）已经成为蜂蜜溯源分析的主要工具。由于蜂蜜基质的复杂性，顶空固相微萃取（二乙烯基苯/Carboxen/涂层纤维聚二甲基硅氧烷）结合二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF/MS)用于分析来自于波兰不同地理位置蜂蜜的挥发性有机化合物成分[10]。在金合欢、椴树、油菜籽、荞麦和蜜露等蜂蜜中共发现并确认了329种化合物，其中82种化合物通过分析物标准识别，实验性认证的247种化合物基于分别将解卷积质谱和线性程序升温保留指数与NIST 2005图书馆和文献值比较。很多波兰蜂蜜确证的挥发性物质也普遍存在于欧洲其他地理区域（如意大利科西嘉岛）。这些易挥发组分包括非环和环状烷烃、非环和环状烯烃、芳香烃、氧化芳香烃、醇类、醛类、酮类、醚类、腈类、有机硫化物、多酚类化合物和萜类。相同类型蜂蜜的GC×GC-TOF/MS图谱是非常相似的，在所有化合物中选出了8个植物源类别。通过比较真实的标准确认识别。而且，验证了波兰蜂蜜的可能地理区分，包括19个金合欢、3个油菜和荞麦、6个蜜露蜂蜜。

将电化学传感器和化学计量学分析结合也为分析蜂蜜中大米糖浆掺假提供了很好的研究思路。采用一个简单的电化学传感器结合化学计量学方法基于抗氧化物质的减少分析中国当归蜂蜜大米糖浆掺假[11]。当蜂蜜掺入大米糖浆后，循环伏安图会有明显的改变。首次从循环伏安图里的电化学信号中提取出十二个变量特征。电流和数量的变量在主成分分析处理后进行判别分析中起着重要作用。主成分分析线性判别分析(PCA-LDA)和LDA模型能够很好的鉴别真假蜂蜜，识别率均达到100%。蜂蜜掺假的定量分析中，多元线性回归(MLR)模型能够准确地在12个主成分中预测R-c 0.921和R-p 0.898。这说明，电子传感器结合化学计量学分析方法在鉴别蜂蜜及其他食物中掺假中有巨大的潜力。此外，研究表明，将紫外光谱法结合化学计量学分析鉴定单花蜜中，如也门锡德蜂蜜[12]。用13种真实的锡德蜂蜜构建模型，25个不同植物源样品进行验证。HCA和PCA分析成功地建立了初步聚类模型并区分真实蜂蜜，低价格的本地多花蜜和非锡德蜂蜜。SIMCA模型能有明确清晰的界定样品，用来鉴别真实Sidr蜂蜜并且通过检测限＞10%检测价格低的多花蜜添加物。

(未完待续)

A review 2013：Domestic and international research on quality safety of bee products

Zhou Jinhui,Guo Weihua,Li Yi,Wu Liming,Xue Xiaofeng,Zhang Jinzhen, Chen Fang,Chen Lanzhen,Wang Peng,Huang Jingping,Yue Jin,Zhao Jing*

This review summarized the domestic and international research on quality safety of bee products and present the distribution of literatures in database and research field.Using data and results from the research in 2013, plus 27 new references from 224 papers,the latest research progeress was provided.We have made a brief summary about multi-residue analysis of veterinary medicine,pesticides and trace elements,endogenous compositions and the latest methods of sample preparaton in bee products.This review has broadened outlook of studies of quality safety in bee products,improved effectiveness,accuracy and rapidity of the developed method,especially for the routine analysis.

bee products,multi-residue residue,authenticity analysis,the minerals,active compositions

国家蜂产业技术体系建设专项资金资助(CARS-45)和国家自然科学基金(Project No.31201859)

赵静，研究员，从事蜂产品质量安全研究与评价工作，E－mail:zhaojingjun@sina.com.