近红外荧光染料IR-783介导的肿瘤成像

张彩勤，张海，赵勇，毛峰峰，白冰，师长宏

(第四军医大学实验动物中心， 西安 710032)

近红外荧光染料(near infrared dye, NIR)是一类聚甲基菁染料的杂环化合物，自发荧光低[1]，但与体内大分子结合后由于荧光团的聚集展示出强的荧光素；利用近红外荧光进行活体成像具有非侵袭性、分辨率高、无辐射、可动态成像等优点[2]，目前成为分子影像的研究热点，并广泛应用于肿瘤研究领域。事实上利用荧光染料进行肿瘤的检测和诊断还面临一系列的问题[3,4]，如常用的肿瘤成像是将近红外荧光染料通过与肿瘤特异的配体发生化学偶联来实现的，肿瘤特异的配体包括代谢底物、适体、生长因子和抗体等，已有文献报道NIR荧光染料与细胞膜受体、胞外基质、癌细胞特异的标志分子和新生血管内皮细胞特异的标志分子等作用的机制[5]。上述NIR染料肿瘤成像的缺陷是只能检测到部分具有特异表面标志的癌细胞类型，而且这种化学偶联机制可能改变靶标配体的特异性和亲和力[6]。因此，迫切需要开发一种NIR荧光染料，使肿瘤成像变得更简单、更有效。

IR-783是一种七次甲基荧光染料，它既可以被激发出近红外荧光，又可以作为靶标配体，能够被癌细胞摄取并富集，而不需要通过化学偶联的途径[7]，具有成像和靶分子的双重功能。本实验主要通过观察近红外荧光染料IR-783在自发性肿瘤犬中的成像效果，探索IR-783用于临床肿瘤诊断的前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 荧光染料

近红外荧光染料IR-783(excitation, 760～800 nm；emission, 820～860 nm)，由美国洛杉矶Cedars-Sinai Medical Center馈赠[7]。

1.1.2 仪器设备

Caliper Lumina II 小动物光学成像系统；Olympus IX71荧光显微镜。

1.1.3 实验动物

裸鼠，雌性，8～10 周，6只，来源于第四军医大学实验动物中心【SCXK(军)2012-0007】，饲养于第四军医大学实验动物中心【SYXK(军)2012-0023】；犬由第四军医大学实验动物中心宠物医院提供，实验过程均经过第四军医大学实验动物伦理委员会的批准，并按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

前列腺癌细胞PC-3和胃癌细胞SGC-7901由第四军医大学实验动物中心提供，将这两株细胞培养至对数生长期，1000 r/min离心，用无血清RPMI-1604培养液制成细胞悬液，在裸鼠后肢背侧皮下注射，每点0.2 mL，注射量为2×106个细胞，3只裸鼠注射PC-3细胞，另外3只裸鼠注射SGC-7901细胞。

1.2.2 IR-783在裸鼠肿瘤模型中的代谢试验[8,9]

当裸鼠的皮下细胞瘤长至直径约0.5 cm时，将IR-783染料按照5 μmol/kg的剂量腹腔注射PC-3肿瘤和SGC-7901肿瘤裸鼠各2只，另外两只荷瘤裸鼠作为无注射对照。注射后每天在Caliper Lumina II 小动物光学成像系统中进行活体荧光成像(ex: 745 nm，em: ICG)，连续观察9 d。

1.2.3 IR-783在犬自发肿瘤中的靶向研究

4只自发肿瘤犬，分别编为1、2、3、4号犬。1号犬是乳房肿瘤，2号犬是面部肿瘤，3号犬为多脏器转移肿瘤，4号犬为肛门部位肿瘤。将IR-783按照1.5 μmol/kg后肢静脉注射4只实验犬，在注射后第5天手术切除肿瘤组织，并取部分正常组织作对照，将切除的组织在Caliper Lumina II 小动物光学成像系统中进行荧光显影，成像后将各部分组织分别用4%多聚甲醛固定，制作HE染色切片进行组织病理学观察，制作冰冻切片用于观察组织的IR-783近红外荧光。

2 结果

2.1 IR-783在裸鼠肿瘤模型中的代谢实验

荷瘤裸鼠腹腔注射5 μmol/kg的荧光染料IR-783后，活体荧光成像连续观察9d，如图1(彩插2)所示，8 d后，体内正常组织非特异性结合的荧光染料基本消失，而在肿瘤组织中仍有很强的特异性荧光显影。

2.2 IR-783在犬自发肿瘤中的成像研究

2.2.1 1号犬的成像结果与组织病理分析

将1号犬切除的肿瘤组织在小动物活体成像仪中进行荧光成像，结果在肿瘤组织中有明显的荧光信号，而在肿瘤附近正常的肌肉组织中无荧光出现(见图2，彩插2)。病理HE结果显示荧光强的组织内部分乳腺细胞的核深染，细胞核大小不均一，具有明显的肿瘤细胞特征(见图2，彩插2)。

2.2.2 2号犬的成像结果与组织病理分析

将2号犬的肿瘤组织及附近眼观正常的组织同时做荧光成像、HE染色切片和冰冻切片，结果发现肿瘤部位有较强的荧光，而眼观正常的组织上只有较弱的荧光(见图3，彩插3)。HE病理结果诊断该肿瘤组织为淋巴瘤(见图3，彩插3)，附近的组织同时有肿瘤细胞侵袭。冰冻切片的荧光观察结果是肿瘤组织的荧光较强，肿瘤附近切除的组织有较弱的荧光(见图3，彩插3)，与HE切片的组织病理结果一致。

2.2.3 3号犬的成像结果与组织病理分析

3号犬在注射IR-783后第7天死亡，进行解剖后发现肝脏和胃已经黏连在一起，肺脏、脾脏等都可见明显的病理变化。切除肝脏、胃、脾脏、肺脏、十二指肠、胸腺的8块组织样品，组织荧光成像、HE染色切片和冰冻切片结果均表明采集的8块组织均有程度不一的肿瘤细胞侵袭或坏死病变(见图4，彩插3)。

2.2.4 4号犬的成像结果与组织病理分析

4号犬在肛门部位有一个较大的肿瘤(见图5A，彩插3)，手术切除了整个的肿瘤组织，选取较小的一块肿瘤组织和两块带有正常组织的肿瘤进行了荧光成像和HE切片观察，结果发现在肿瘤组织处可见较强荧光信号，正常的组织未见荧光显影(见图5B，彩插3)。组织病理HE分析结果与荧光检测一致。

3 讨论

Ntziachristos 等[10]已证实近红外荧光最大可穿透12 cm的乳腺或肺组织、6 cm的肌肉组织和5 cm的成人脑组织，在癌症研究和肿瘤检测中显示出较多的优势[11]，各种各样的花菁衍生物被开发用于检测癌细胞[12-14]。本研究使用的IR-783荧光染料发射波长(820～860 nm)较一般可见的荧光染料更长，经过前期的修饰，已具有突出的优势：不需要化学偶联即可以直接检测癌细胞和癌症转移灶；能够检测出许多不同类型的肿瘤细胞群[7,15]。无论染料本身的稳定性还是检测结果的信噪比都相对更好，在细胞组织水平的研究中具有一定优势[16,17]。

本实验通过荧光成像和组织病理分析证实了近红外荧光染料IR-783可与犬的肿瘤组织特异性结合，并在肿瘤部位富集，具有一定的靶向性能力。同时，选用不同类型的肿瘤模型表明了IR-783与肿瘤细胞结合的广泛性。已有的报道证实IR-783染料能够聚集在癌细胞的线粒体和溶酶体部位，可能是通过有机阴离子转移肽系统(OATPs)将IR-783运输进入癌细胞并贮留在癌细胞中而非正常细胞中。而OATPs在人类的多种肿瘤组织和多种肿瘤细胞系中大量表达[18]，这可能也是IR-783能够与肿瘤细胞特异性结合的分子机制。

已有NIR荧光染料成像研究均采用小鼠肿瘤模型，其实验结果与人体研究存在较大差别。研究发现犬的基因组与人的基因组相似度远远高于啮齿类动物与人[19]；犬的肿瘤模型在组织病理特点、遗传特性、生物行为学以及对治疗的反应性方面具有人体肿瘤的基本特点[20]。同时，使用犬的肿瘤模型开展非临床研究可以解决在其他肿瘤模型中无法解决的问题。因此，本实验在完成裸鼠肿瘤模型研究的基础上，选用犬的自发肿瘤模型开展了IR-783近红外荧光染料的靶向作用研究，证明了该染料与肿瘤组织结合的特异性，为其应用于临床肿瘤成像研究奠定了实验基础。

实验过程中由于Caliper Lumina II 小动物光学成像系统的成像范围有限(一次只能成像三只小鼠)，犬的表皮组织较厚，近红外染料无法穿透，导致不能在犬活体进行肿瘤组织的荧光成像，只能是将组织切除后选取病变典型的组织在活体成像仪中显影。通过活体成像对照组织病理分析结果确诊组织的形态和结构，进一步验证二者的一致性。本实验中选取了4只自发肿瘤犬进行研究，数量有限。后续实验将大量收集不同来源的自发肿瘤犬进行肿瘤成像的研究，累积研究结果，积极与临床病理诊断结果相比较，更加深入地研究IR-783染料在肿瘤检测领域的应用。

(本文图1,2见彩插2,图3～5见彩插3。)

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