PTTG1影响胶质瘤细胞侵袭力机制的研究

陈为一 李小龙 齐岳亮 李洪利 尹崇高 刘晓丽 张宝刚 郭文君*

1.潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊261053；2.潍坊医学院医学研究实验中心，山东 潍坊261053；3.潍坊医学院护理学院，山东 潍坊 261053

PTTG1影响胶质瘤细胞侵袭力机制的研究

陈为一1 李小龙1 齐岳亮1 李洪利2 尹崇高3 刘晓丽3 张宝刚1 郭文君1*

1.潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊261053；2.潍坊医学院医学研究实验中心，山东 潍坊261053；3.潍坊医学院护理学院，山东 潍坊 261053

背景与目的：研究证实垂体肿瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1)的表达情况与各类肿瘤细胞的恶性程度有关，但是其在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PTTG1在恶性胶质瘤侵袭中的作用及其临床意义。方法：应用蛋白质印迹法(Western blot)检测PTTG1蛋白在不同胶质瘤细胞系中的表达；采用小RNA质粒干扰技术抑制U87细胞中PTTG1蛋白的表达，应用Western blot技术检测转染的效率；通过体外侵袭实验检测转染后细胞侵袭力的变化；采用Western blot技术检测经过表皮细胞生长因子(epithelial growth factor，EGF)刺激后敲除PTTG1的细胞组(siPTTG1/U87)与转染空载的细胞组(Scr/U87)中Akt、ARK5磷酸化的情况。结果：PTTG1蛋白在各恶性胶质瘤细胞系中均高表达；敲除PTTG1后U87细胞的侵袭力明显下降；对Scr/U87细胞进行EGF刺激5 min后，Akt、ARK5的磷酸化情况显著增强，而无论有无EGF的刺激，siPTTG1/U87中Akt、ARK5的磷酸化情况都没有明显改变。结论：在恶性胶质瘤细胞中，PTTG1蛋白呈高表达状态并且与侵袭性显著相关，其对侵袭性的调控可能是通过Akt-ARK5通路实现的。

胶质瘤；侵袭；垂体肿瘤转化基因1；ARK5；siRNA

胶质瘤是一种预示着不良预后的实体肿瘤。其早期诊断困难，侵袭性强，即使在肿瘤诊断技术与治疗方法日新月异的今天，全世界胶质瘤患者的预后依然没有显著的提高［1-3］。垂体瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene1，PTTG1)最早是由Pei等［4］通过PCR技术从小鼠的垂体肿瘤细胞中发现的一种原癌基因。随后，研究者在人类的睾丸中用克隆技术也发现了这种基因［5］。PTTG1被认为与肿瘤细胞的恶性程度和不良预后有关［6］。有研究表明，PTTG1与乳腺癌的复发和淋巴结转移有关［7］。但是，PTTG1是否与胶质瘤的高侵袭性有关鲜见报道。已有研究证明，PTTG1位于PI3K/Akt通路的上游［8］，并且本实验室的前期研究成果表明，ARK5对胶质瘤的侵袭性有促进作用，并且与胶质瘤患者的不良预后有密切关系［9］。因此，本研究旨在探讨PTTG1在恶性胶质瘤侵袭中的作用及临床意义，并进一步分析影响胶质瘤细胞的侵袭现象的分子机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

正常星形细胞NHA购自美国ScienCell研究实验室；U87、U251、LN-299细胞系购自美国ATCC细胞库；RPMI-1640培养液购自美国Hyclone公司；一抗PTTG1购自美国Santa Cruz公司；一抗ARK5、p-ARK5、p-AKT购自美国Cell Signaling公司；表皮细胞生长因子(epithelial growth factor，EGF)购自美国R&D systems公司。胰蛋白酶、彩色预染蛋白、DOO18质粒中量抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；侵袭实验所用24孔细胞培养板购自美国Corning公司；Matrigel膜基质购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司；24孔趋化小室、细胞转染试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

U87、U251和LN-299细胞系均购自美国ATCC细胞库，属于人恶性胶质瘤细胞系，具有高侵袭性。人类正常的星形细胞(normal human astrocytes，NHA)，购自美国ScienCell研究实验室，无侵袭性。4种细胞均根据公司建议，采用常规细胞培养，操作参照本实验室人员姬静等［10］的研究。

1.2.2 质粒构建与细胞转染

本研究所用质粒PTTG1 siRNAs由上海吉玛制药技术有限公司合成。取对数生长期的U87细胞做实验，细胞分3组：①U87细胞，常规培养，不做任何处理；②Scr/U87细胞，瞬时转染插入具有一段乱码序列的质粒做对照；③siPTTG1/U87，瞬时转染插入具有目标片段5′-GACCCUGGAUGUUGAAUUG-3′的质粒。转染步骤参照转染试剂说明书。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blot)实验

具体操作参照姬静等［10］的研究。将转染后的siPTTG1/U87细胞和Scr/U87细胞培养72 h后提取蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，蛋白质变性后电泳、转膜、封闭，滴加一抗PTTG1、Akt、pARK5、pAkt进行温育，二抗温育后显影。

1.2.4 体外癌细胞侵袭能力检测

按姬静等［10］的研究操作。结果置400倍光镜下观察，5个高倍镜视野，计数Boyden小室下室面的细胞数即为穿透人工基膜的细胞数，每个实验重复3次，取平均数作为实验结果。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料之间的比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTTG1蛋白在胶质瘤细胞系中高表达

对4种细胞系常规培养后，待细胞长到80%满，提取蛋白做Western blot检测。实验结果显示，PTTG1蛋白在各恶性胶质瘤细胞系中均高表达，而在人类正常的星形细胞中不表达(图1)。

图1 PTTG1在不同细胞系中的表达Fig. 1 The expression of PTTG1 in different cells

2.2 PTTG1在siPTTG1/U87和SCR/U87中的表达

瞬时转染后继续培养72 h，然后提取蛋白，应用Western blot实验检测蛋白含量。结果显示PTTG1的表达在siPTTG1/U87细胞中明显比在Scr/U87细胞中低(图2)。提示细胞转染成功。

图2 PTTG1在siPTTG1/U87细胞和Scr/U87细胞中的表达Fig. 2 The expression of PTTG1 in the siPTTG1/U87 and Scr/ U87

2.3 PTTG1对胶质瘤细胞U87侵袭和转移能力的影响

转染小RNA干扰质粒成功之后，进行transwell实验，固定染色后结果见图2。经过SPSS统计软件分析，实验组穿透Matrivgel基质膜的细胞数(20.00±5.31)少于对照组细胞(40.00±4.48)，差异有统计学意义(t=11.1，P=0.000)。

图3 体外侵袭实验观察PTTG1对U87细胞侵袭力的影响Fig. 3 The in fl uence of PTTG1 in the invasion of U87 in vitro (Giemsa, ×400)

2.4 EGF刺激细胞，检测ARK5和Akt的磷酸化

为了研究PTTG1影响胶质瘤细胞侵袭力现象的分子机制，本研究对Scr/U87细胞和siPTTG1/U87使用10 ng/mL EGF在无血清的培养基中分别刺激0和5 min，分析Akt与ARK5的磷酸化情况。结果显示，在EGF刺激5 min后，Scr/U87细胞中Akt、ARK5的磷酸化增强；而siPTTG1/U87中，经过EGF刺激5 min，Akt、ARK5磷酸化的水平均没有明显变化(图4)。

图4 EGF刺激后siPTTG1/U87细胞和Scr/U87细胞中Akt和ARK5磷酸化的变化Fig. 4 The differences of phosphorylation of Akt and ARK5 in the siPTTG1/U87 and Scr/U87 cells after EGF stimulation

3 讨 论

神经胶质瘤是人类高度恶性的肿瘤之一，儿童和50～60岁的人群是本病的高发人群，目前尚难以对其进行早期诊断和有效的治疗。因胶质瘤具有高度的侵袭性，几乎不可能进行完整的手术切除，所以常会导致患者的残疾甚至死亡［2］。

PTTG1是于1997年发现的一种原癌基因，在人类的睾丸和胸腺组织中高表达，在其他的组织中低表达，并且在很多的肿瘤组织和肿瘤细胞系中高表达。研究证明，PTTG1蛋白的表达与神经胶质瘤的恶性程度和不良预后成正相关。因此，本研究考虑PTTG1与胶质瘤的高侵袭性有一定关系。本实验结果表明，成功将PTTG1质粒转染进U87细胞后，对siPTTG1/ U87细胞和SCR/U87细胞进行体外侵袭实验。染色后显微镜下观察，siPTTG1/U87与Scr/U87相比镜下细胞数目明显减少。说明敲除PTTG1后，胶质瘤细胞系U87的侵袭力显著减弱，证明PTTG1与胶质瘤的侵袭性有影响。

ARK5作为AMPK亚家族的成员之一，是Akt的下游信号分子［11］。有研究证明，Akt与ARK5在肿瘤细胞的侵袭中有重要作用［12-13］。本研究前期的研究也已经证明，ARK5影响了胶质瘤细胞的侵袭性［9］。因此，PTTG1导致的人恶性胶质瘤的高侵袭性可能与Akt-ARK5通路有关。

EGF是人体内的一种活性物质，由刺激表皮细胞生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)使酪氨酸磷酸化，促进细胞的增值分化。EGFR是酪氨酸激酶受体，EGF与EGFR结合后，引起下游PI3K/Akt的磷酸化激活。本研究的前期研究表明ARK5位于Akt的下游［9］。本研究结果显示，对SCR/U87细胞进行EGF刺激5 min后，ARK5的磷酸化明显升高。而对siPTTG1/U87细胞进行EGF刺激5 min后，ARK5的磷酸化并没有显著变化。说明PTTG1影响胶质瘤细胞的侵袭性可能是通过Akt-ARK5通路是实现的。

综上所述，本研究证实，PTTG1在恶性胶质瘤的侵袭性中扮演重要角色，并且这种调控可能是通过Akt-ARK5通路实现的。纠正PTTG1蛋白在胶质瘤细胞中的高表达不仅可以有效的降低其侵袭性，而且可以提高恶性胶质瘤患者的生存率并改善预后。

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Effect of PTTG1 in the invasion of glioma cells

CHEN Wei-yi1, LI Xiao-long1, QI Yue-liang1, LI Hongli2, YIN Chong-gao3, LIU Xiao-li3, ZHANG Bao-gang1, GUO Wen-jun1(1. Department of Pathology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 3. College of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China)

Background and purpose:Numerous researches indicated that the expression of pituitary tumor transforming gene1 (PTTG1) was correlated with the severity of glioma tumors. However the specific mechanism of PTTG1 is not clear in glioma. In this study, we explored the role and significance of PTTG1 in the invasion of glioma cells.Methods:Western blot was used to detect the expression of PTTG1 protein in various glioma cell lines. siRNA plasmid was used to transfect U87 cells. Western blot was used to analyze the expression of PTTG1 protein in transfected U87 cells. Matrigel invasion assay was used to detect the invasive ability in the cells being transfected in vitro. Western blot was used to analyze epithelial growth factor (EGF) induced protein phosphorylation of ARK5 and Akt in the cells being transfected PTTG1 plasmid (siPTTG1/U87) and scrambled siRNA (Scr/U87).Results:The expression of PTTG1 protein was higher in all glioma cell lines. After transfection, the invasion of siPTTG1/U87 was obviously decreased after 5 min with EGF stimulation than the Scr/U87, the phosphorylation of ARK5 and Akt was significantly enhanced. However, whether or not the existence of EGF, the phosphorylation of ARK5 and Akt had

Glioma; Invasiveness; PTTG1; ARK5; siRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.002

R739.41

A

1007-3639(2014)05-0329-04

2013-11-18

2014-04-06）

国家自然科学基金(No: 81072068)；山东省中青年科学家科研奖励基金(No:2010BSB14050、BS2011YY060)；山东省高等学校科技计划(No: J12LK03、J13LK03)；潍坊医学院青年科技创新基金(No: K11QC1002)。

郭文君 E-mail:13963669930@163.com

no differences in siPTTG1/U87.Conclusion:In glioma cells, PTTG1 protein is high expressed and maybe have an important function in glioma cells invasion through Akt-ARK5 signaling pathway.