RNA干扰技术在植物品质改良和病虫害防治中的应用

王爱英，傅 强，赖凤香，王渭霞

(中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，浙江 杭州 310006)

RNA干扰 (RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)导致细胞内同源mRNA发生特异性降解的过程［1］。其发现可追溯到1990年，为培育颜色更深的紫色矮牵牛花，将查耳酮合酶基因转入牵牛花中，结果许多花朵的颜色不但没有加深，反而变成白色或花白色，这种现象被称为共抑制 (cosuppression)。这种共抑制现象之后被确认是发生在转录后水平，因此又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)［2］。RNAi现象普遍存在于真菌、果蝇、线虫、涡虫、植物及动物等大多数真核生物中，它可以阻断生物体内特定基因的表达，从而使细胞表现出特定基因缺失的表型，是一种在进化上高度保守的调节机制［3-4］。随着科学研究的深入，人们已经从多种生物中分离出参与RNAi的一些关键基因，也对RNAi产生的基本机制有了较深入的了解，RNAi在植物品质改良和病虫害防治上的应用也已取得丰硕成果。随着研究的不断深入，RNAi将在植物学研究领域发挥越来越重要的作用。

1 机制和特点

1.1 机制

在大量的生化和遗传学研究基础上，植物学家逐步总结出了植物的RNAi作用机制模型，认为RNAi可以分为以下3个阶段:起始阶段、效应阶段和扩增阶段。在起始阶段，dsRNA是诱导细胞产生RNAi的关键成分，转基因、病毒感染及转座子活动等都能使细胞产生dsRNA。这些dsRNA在内切核酸酶作用下，经由 Dicer(DICER-like，DCL)酶将dsRNA处理为21～25 nt大小的siRNA(small-interference RNA)。起始阶段产生的siRNAs的一条链与RNA沉默复合物结合 (RNA-induced silencing complex，RISC)，从而阻断基因的表达。之后，以mRNA为模板，siRNA为引物，在RNA依赖 的 RNA聚 合 酶 (RNA-directedRNA polymerase，RdRp)作用下，通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割产生次级siRNA，次级siRNA又进入下轮循环，这样就产生了一种级联放大的效应［5］。

1.2 特点

1.2.1 RNAi的序列特异性

导入到生物体内的siRNA上的一对碱基突变就会抑制沉默效应，表明RNAi具有高度的序列特异性［6］。转化大麦黄矮 (BYDV2PAV)的多聚酶基因反向重复序列载体 (hp BYDVpol)的转基因植株，仅对大麦黄矮病毒免疫，而对谷类该病毒感染，也从另一面证明了RNAi技术的序列特异性［7］。RNAi高度的序列特异性使得dsRNA只能特异地降解与之序列同源的mRNA，而不会对其他基因产生影响，从而保证了对目的基因的精确沉默。

1.2.2 RNAi的高效性

RNAi存在级联放大效应，双链RNA在Dicer酶催化下形成siRNA，siRNA解链后一种是直接靶向结合mRNA，另一种是解链后与RISC形成复合物，这些RISC可以专一性地与靶向的mRNA特异性结合。根据单链siRNA结合位点或RISC结合位点，在RDRP(RNA依赖性的RNA聚合酶)作用下可以形成新的双链RNA，后者被Dicer酶特异性地识别而将双链RNA切断，形成新的siRNA而再循环作用于靶向mRNA。RNAi途径一旦被启动，就可以高效沉默基因的表达，因此每个细胞只需少量的dsRNA就可以使目标基因沉默［8］。向细胞内导入针对多个基因的dsRNA，还可以一次性沉默多个基因。此外，与棕榈酸结合的C16-dsRNAs具有很高的膜通透性，而且具有很高的基因沉默效率［9］。由此可见，RNAi过程具有类似生物催化酶反应的高效性。

1.2.3 RNAi的扩散性和可遗传性

RNAi的扩散性是指沉默信号可以沿其同源序列的DNA向该目的基因的非同源区域扩散，或者指沉默信号从一个已经发生沉默的细胞内转到新的细胞里。目前已证实，在植物RNAi过程中siRNA充当沉默信号［10］。对植物细胞RNAi运动的研究表明，RNAi信号是可以传输给附近有限细胞的。但是，要进行细胞之间长距离运输的话，就需要借助于SDE1(一类RDRP酶)和sDE(一类RNA螺旋酶)之间的相互作用，以及胞间连丝的参与［11-12］。通过嫁接，沉默信号可以在砧木和接穗之间双向传递;而且沉默信号可以在不同的物种个体间传递，如植物与取食植物的昆虫之间;此外，沉默效应甚至可以传递给后代［13］。

1.2.4 RNAi的高稳定性和不对称性

siRNA的3'端有突出的TT或UU碱基，因此化学性质很稳定，无需像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期［1］。在RNAi作用中有一个关键的步骤，就是RISC的装配，RISC可以调控目标RNA的降解。然而，RISC在装配过程中具有不对称性，siRNA的2条链并不都能组装成RISC复合体，这取决于siRNA 2条链5'端碱基对所具有的特点［14］。

2 在植物品质改良中的作用

随着RNAi机理的不断阐明及将dsRNA引入植物细胞的方法取得成功，采用RNAi技术进行作物品质改良已显现出巨大的潜力。目前，利用RNAi技术已经成功地进行了多种作物不同方面的品质改良，现综述如下。

2.1 提升农作物品质

2.1.1 改良油脂品质

各类脂肪酸组分及其比例是决定农作物油脂品质的重要指标之一，提高种子中油酸和硬脂酸含量是植物油脂基因工程改良的一个主要目标。研究表明，利用RNAi技术可将棉花籽油中硬脂酸含量从非转基因的2%～3%提高到40%，油酸含量从15%提高到77%［15-16］。将脂肪酸脱氢酶基因沉默，可以使甘蓝型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分别升高到 89%和 75%［17］。研究人员还利用RNAi技术获得了油菜FAE1基因功能缺失的突变体，可以调控芥酸含量，从而提高菜油的营养价值［18］。

2.1.2 改良淀粉品质

淀粉是重要的工业原料，利用RNAi技术改变代谢的物质流方向，来提高工业加工原料在作物中的含量，是一种十分有效的方法。通过RNAi调控玉米淀粉支酶 (SBE)基因，可将直链淀粉的含量提高约50%［19］。抑制小麦 SBEIIa和 SBEIIb基因表达，可使籽粒直链淀粉含量提高到70%以上，更有利于人体健康［20］。将红薯Waxy基因沉默，可以培育出低直链淀粉含量的转基因个体［21］。通过RNAi转基因技术，研究人员还获得了极限糊精酶活性只有野生型10%的转化株系，有望培育出高淀粉含量的水稻［22］。

2.1.3 提高植物营养物质或有效成分

通过RNAi技术对番茄的光信号传导基因LeHY5和LeCOPILIKE进行调控，可以大幅度改变番茄果实的色素积累和营养品质［23］。抑制番茄DET1(一类内源性光形态发生作用调控基因)基因提高了番茄类胡萝卜素和黄酮醇这两种营养物质的含量［24］。抑制Lyeε环化酶活性的转基因马铃薯块茎中β-胡萝卜素的含量增加了14倍，类胡萝卜素总量增加了2.5倍［25］。此外，应用RNAi技术还得到了高质量的富含赖氨酸的玉米种子［26］。

利用RNAi技术抑制药用植物无药效产物合成途径上的一些关键酶基因表达，可以减少甚至抑制无药效产物的生物合成，从而提高药用植物品质。如应用RNAi技术抑制罂粟中可待因酮还原酶基因家族基因的表达，可以极大地提高罂粟中含吗啡的量［27］。抑制黄连中异喹啉生物合成途径中金黄紫堇碱90甲基转移酶基因的表达，可以使该酶的表达水平明显降低［28］。敲除罂粟细胞中BBE基因可以积累大量的牛心果碱［29］。沉默艾草中的鲨烯合酶SQS，可以使植株中的一种抗疟疾药物 (青蒿素)含量显著增加［30］。

2.1.4 降低植物有害物质含量

应用RNAi技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶基因的表达，可以使转基因植物中可可碱含量下降30%～80%，咖啡因含量下降50%～70%，有利于降低对咖啡因敏感人群的刺激，并可减少因食用咖啡而引发的心悸、高血压、失眠等症状［31］。抑制亚麻苦苷和百脉根苷合成途径中的两个关键酶CYP79D1和CYP79D2的表达，得到的转基因木薯块茎中氰苷含量降低92%、叶片中氰苷含量低于野生型氰苷含量的1%，极大改善了木薯的营养价值［32］。抑制棉籽中棉酚合成途经中δ-杜松烯合成基因的表达可使棉籽中棉酚含量降低99%，而叶片及花中的萜类化合物并不会因此减少，其对病害及昆虫的抗性亦无明显降低［33］。抑制产生催泪因子的LF合酶的活性，可以产生不使人流泪的洋葱［34］。沉默烟草中的脱甲基酶基因，去甲烟碱的含量仅为对照的1/7，能导致动物发生癌变的NNN含量也明显降低［35］。

2.2 改良园艺植物的性状

植物花的颜色和香味因其巨大的经济价值和审美价值，一直以来都是园艺植物育种研究的热点。牵牛花中查尔酮异构酶 (CHI)基因促使花瓣颜色加深，康乃馨中的CHI活性降低会使得黄色素沉着［36］。抑制查尔酮异构酶 (CHI)基因促使烟草花瓣的颜色由白色变成粉白色［37］。在郁金香中过量表达TgVitl基因和抑制TgFER1基因的表达，致使郁金香花底部的蓝色出现非常明显的变化［38］。抑制矮牵牛中的松柏醇酰基转移酶的活性，可使牵牛花的香味发生改变［39］。

2.3 提高植物果实的品质

植物果实的品质主要包括营养价值、果实味道、加工质量和果实的货架期。植物果实成熟过程中，由乙烯诱发的信号级联和相关基因共同参与调控植物果实的成熟以至腐烂变质［40］。应用 RNAi技术干扰番茄乙烯相关的ACC氧化酶基因，结果有69%的转化植株表现出100%的干扰效果，果实从破色期到成熟期时间延长115 d［41］。干扰番茄ACO基因，导致乙烯的生成大大降低，由于RNAi技术能有效抑制靶基因的表达，因此是改良番茄耐贮性的有效手段［42］。多酚氧化酶 (PPO)是植物体内普遍存在的一种酶，PPO所引起的反应常使果肉发生褐变，损失营养。同时用反义RNA技术和sense RNAi技术抑制PPO活性，可以有效控制马铃薯的褐变［43］。

此外，有些植物果实中含有坚硬的种子而且味道很差，而近年来，无籽果实更受消费者青睐。应用RNAi技术抑制番茄中ARF7基因的表达，可以获得转基因无籽番茄［44］。抑制植物AUCSIA基因的表达，可以获得无籽果实，而且果实中查尔酮合成酶的含量降低［45］。

3 在植物病虫害防治中的应用

3.1 抗病

研究表明，RNAi是植物抵抗病毒感染的防御机制之一。目前，许多研究已经可以利用RNAi方法控制单链DNA或RNA病毒［46］。研究人员利用RNAi技术获得了对黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)具有系统抗性的植株，并能在植株体内检测到CP序列特异的siRNA［47］。沉默水稻矮缩病毒的一个病毒原质基质蛋白基因Pns12，结果转基因水稻获得了对该病毒的抗性［48］。此外，研究人员还获得了对苜蓿花叶病毒、豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒都具有抗性的转基因植株［49］。利用RNAi研究水稻条纹病毒 (RSV)，构建了针对RSV外壳蛋白和疾病特异性蛋白的两种沉默表达载体，然后将它们导入水稻植株，结果转基因水稻对RSV 的抗性显著增加［50］。

利用两种根癌农杆菌介导的iaam和ipt基因沉默，可以减少拟南芥冠缨瘤的形成。此外，基于RNAi的研究还发现，水稻中OsRAR1基因兼抗稻瘟病菌和细菌性疫病［51］，表明真核生物宿主细胞不仅可以通过 RNAi防御病毒侵染，也能利用siRNA防御细菌侵染，这对植物细菌性病害的防治有积极意义。

线虫在取食RNAi植物后，相应的4个甜菜孢囊线虫线虫基因表达丰度显著降低，且成熟雌性线虫减少23% ～64%［52］。将酪氨酸磷酸酶 (TP)和线粒体应激70蛋白前体 (MSP)的RNAi结构导入大豆根部，由根结线虫引起的虫瘿减弱，同时根结线虫与对照组相比个体也明显变小［53］。将南方根结线虫POS-1基因的dsRNA接种到番茄的根部，接着用根结线虫侵染根部发现，根结线虫的孵化率与对照组相比明显降低［54］。

3.2 抗虫

在植物抗虫方面，利用RNAi也取得了很多研究进展。为了有效地控制害虫，害虫应该能够自然地通过饲喂和消化获得dsRNA/siRNA［55］。通过饲喂转基因植物诱导RNAi防治害虫已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功［56-57］。

研究发现表达P450基因 (CYP6AE14)和谷胱甘肽基因 (GST1)dsRNA的棉花对取食的棉铃虫(H.armigera)幼虫诱导了RNAi，阻碍了幼虫的发育，这一技术为防治农作物害虫提供了新的策略［58］。研究人员利用RNAi研究了褐飞虱的中肠基因，他们将3种中肠基因的dsRNA导入水稻植株，然后喂食褐飞虱，结果发现，褐飞虱中这3种基因的表达都受到抑制，但是褐飞虱并没有出现致命性死亡［59］。以上研究表明，在植物中表达与昆虫同源的双链RNA，可以触发取食昆虫体内发生RNA干扰，进而影响昆虫生长甚至杀死昆虫。而且利用RNAi技术防治害虫具有很高的特异性，不会对其他有益昆虫产生影响，RNAi在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。

4 展望

RNAi介导的基因沉默是植物在基因调控水平上的自我保护机制，是一种高效、特异性强的基因阻断技术，在作物品质改良、病虫害防治等方面发挥着重要作用。转BT基因的作物已成功控制了多种害虫危害，但是目前也已见对BT产生抗性的报道［60］。将RNAi技术和BT技术同时应用来控制害虫是一个新的防治策略。此外，研究还发现，通过体壁吸收dsRNA可导致亚洲玉米螟的生长发育迟缓和死亡，表明双链RNA能够通过鳞翅目昆虫的体壁，影响幼虫发育并最终导致死亡［46］，这也为今后的昆虫防控提供了一个新的视角和思路。

在昆虫中，可以应用大量的dsRNA来实现基因沉默，研究表明，50 ng·mg-1组织的浓度对哺乳动物尚无明显的副作用［61］。虽然基因的差异是一个重要因素，但昆虫和哺乳动物的dsRNA用量还需进一步的研究。

传统农作物作为主食，被人们大量食用，但有些食物成分会引起消化不良甚至诱发中毒。应用RNAi技术可以在一定程度上提高农作物的营养成分，并能从可食用部分去除天然有毒化合物，从而确保营养安全，保障人们的饮食健康［62］。随着人们对RNAi技术的深入研究，该技术必将在植物学研究的各领域发挥日益重要的作用。

［1］Elbashir S M，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammaliancells ［J］. Nature， 2001， 411(6836):494-498.

［2］Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans［J］.The Plant Cell Online，1990，2(4):279-289.

［3］Sharp P A. RNA interference-2001 ［J］. Genes ＆Development，2001，15(5):485-490.

［4］和琼姬，燕飞，陈剑平.RNA干扰机制及其主要蛋白因子研究进展［J］.浙江农业学报，2011，23(2):415-420.

［5］Sijen T，Fleenor J，Simmer F，et al.On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing ［J］.Cell，2001，107(4):465-476.

［6］Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.cience，2002，296(5567):550-553.

［7］Wang M B，Abbott D C，Waterhouse P M.A single copy of a virus‐derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to Barley yellow dwarf virus ［J］.Molecular Pant Pahology，2000，1(6):347-356.

［8］Brantl S.Antisense-RNA regulation and RNA interference［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Gene Structure and Expression，2002，1575(1):15-25.

［9］Kubo T，Yanagihara K，Takei Y，et al.Lipid-conjugated 27-nucleotide double-stranded RNAs with dicer-substrate potency enhanceRNAi-mediated gene silencing ［J］. Molecular Pharmaceutics，2012，9(5):1374-1383.

［10］Dunoyer P，Schott G，Himber C，et al.Small RNA duplexes function as mobile silencing signals between plant cells［J］.Science，2010，328(5980):912-916.

［11］Himber C，Dunoyer P，Moissiard G，et al.Transitivity ‐dependent and‐independent cell‐to‐cell movement of RNA silencing ［J］.The EMBO Journal，2003，22(17):4523-4533.

［12］Mallory A C，Mlotshwa S，Bowman L H，et al.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencing signal depends on the nature of the inducing transgene locus ［J］.The Plant Journal，2003，35(1):82-92.

［13］Melnyk C W，Molnar A，Baulcombe D C.Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals ［J］.The EMBO Journal，2011，30(17):3553-3563.

［14］Schwarz D S，Hutvágner G，Du T，et al.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex ［J］.Cell，2003，115(2):199-208.

［15］Liu Q，Singh S，Green A.Genetic modification of cotton seed oil using inverted-repeatgene-silencing techniques［J］.Biochemical Society Transactions，2000，28(6):927.

［16］Liu Q，Singh S P，Green A G.High-stearic and high-oleic cottonseed oilsproduced by hairpin RNA-mediated posttranscriptional gene silencing ［J］.Plant Physiology，2002，129(4):1732-1743.

［17］Stoutjesdijk P A，Singh S P，Liu Q，et al.hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing ［J］.Plant Physiology，2002，129(4):1723-1731.

［18］田保明，陈占宽，杨光圣，等.基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1及转基因油菜的获得［J］.中国油料作物学报，2007，29(2):133-137.

［19］柴晓杰，王丕武，关淑艳，等.应用 RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量［J］.植物生理与分子生物学学报，2006，31(6):625-630.

［20］Regina A，Bird A，Topping D，et al.High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(10):3546-3551.

［21］Shimada T，Otani M，Hamada T，et al.Increase of amylose content of sweetpotato starch by RNA interference of the starch branching enzyme II gene(IbSBEII)［J］ .Plant Biotechnology，2006，23(1):85-90.

［22］黄冰艳，李忠谊，吉万全，等.利用RNA干扰技术抑制水稻淀粉极限糊精酶基因表达 ［J］.农业生物技术学报，2007，15(1):71-75.

［23］Liu Y，Roof S，Ye Z，et al.Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences oftheUnited StatesofAmerica， 2004， 101(26):9897-9902.

［24］Davuluri G R，Van Tuinen A，Fraser P D，et al.Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes ［J］.Nature Biotechnology，2005，23(7):890-895.

［25］Diretto G，Tavazza R，Welsch R，et al.Metabolic engineering of potato tuber carotenoids through tuber-specific silencing of lycopene epsilon cyclase ［J］.BMC Plant Biology，2006，6(1):13.

［26］Huang S，Frizzi A，Florida C A，et al.High lysine and high tryptophan transgenic maize resulting from the reduction of both 19-and 22-kD α-zeins ［J］.Plant Molecular Biology，2006，61(3):525-535.

［27］Allen R S，Millgate A G，Chitty J A，et al.RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy ［J］.Nature Biotechnology，2004，22(12):1559-1566.

［28］Dubouzet J G，Morishige T，Fujii N，et al.Transient RNA silencing of scoulerine 9-O-methyltransferase expression by double stranded RNA in Coptis japonica protoplasts ［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2005，69(1):63-70.

［29］Fujii N，Inui T，Iwasa K，et al.Knockdown of berberine bridge enzyme by RNAi accumulates(S)-reticuline and activates a silent pathway in cultured California poppy cells ［J］.Transgenic Research，2007，16(3):363-375.

［30］Zhang L，Jing F，Li F，et al.Development of transgenic Artemisia annua(Chinese wormwood)plants with an enhanced content of artemisinin，an effective anti‐ malarial drug，by hairpin‐RNA‐mediated gene silencing［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2009，52(3):199-207.

［31］Ogita S，Uefuji H，Yamaguchi Y，et al.RNA interference:producing decaffeinated coffee plants ［J］.Nature，2003，423(6942):823.

［32］Jørgensen K，Bak S，Busk P K，et al.Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside content in leaves and tubers.Distribution of cyanogenic glucosides，their site of synthesis and transport，and blockage of the biosynthesis by RNA interference technology ［J］. PlantPhysiology， 2005， 139 (1):363-374.

［33］Sunilkumar G，Campbell L A M，Puckhaber L， et al.Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissuespecific reduction of toxic gossypol［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(48):18054-18059.

［34］Eady C C， Kamoi T， Kato M，et al.Silencing onion lachrymatory factor synthase causes a significant change in the sulfur secondary metabolite profile ［J］.Plant Physiology，2008，147(4):2096-2106.

［35］Lewis R S，Jack A M，Morris J W，et al.RNA interference(RNAi)‐induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves ［J］.Plant Biotechnology Journal，2008，6(4):346-354.

［36］Muir S R，Collins G J，Robinson S，et al.Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols ［J］.Nature Biotechnology，2001，19(5):470-474.

［37］Nishihara M， Nakatsuka T， Yamamura S. Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene ［J］.FEBS Letters，2005，579(27):6074-6078.

［38］Shoji K，Momonoi K，Tsuji T.Alternative expression of vacuolar iron transporter and ferritin genes leads to blue/purple coloration of flowers in tulip cv.‘Murasakizuisho’［J］.Plant and Cell Physiology，2010，51(2):215-224.

［39］Dexter R，Qualley A，Kish C M，et al.Characterization of a petunia acetyltransferase involved in the biosynthesis of the floral volatile isoeugenol［J］.The Plant Journal，2007，49(2):265-275.

［40］Bapat V A，Trivedi P K，Ghosh A，et al.Ripening of fleshy fruit:molecularinsightand the role ofethylene ［J］.Biotechnology Advances，2010，28(1):94-107.

［41］Xiong A S，Yao Q H，Peng R H，et al.Different effects on ACC oxidase gene silencing triggered by RNA interference in transgenic tomato ［J］.Plant Cell Reports，2005，23(9):639-646.

［42］陈银华，欧阳波，李汉霞，等.番茄 ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯释放的抑制［J］.农业生物技术学报，2007，15(3):464-468.

［43］Coetzer C，Corsini D，Love S，et al.Control of enzymatic browning in potato(Solanum tuberosum L.)by sense and antisense RNA from tomato polyphenol oxidase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(2):652-657.

［44］De Jong M，Wolters‐ Arts M，Feron R，et al.The Solanum lycopersicum auxin response factor 7(SlARF7)regulates auxin signaling during tomato fruit set and development［J］.The Plant Journal，2009，57(1):160-170.

［45］Molesini B，Rotino G L，Spena A，et al.Expression profile analysis of early fruit development in iaaM-parthenocarpic tomato plants ［J］.BMC Research Notes，2009，2(1):143.

［46］Wang Y，Kheir M M，Chai Y，et al.Comprehensive study in the inhibitory effect of berberine on gene transcription，including TATA box ［J］.PloS One，2011，6(8):e23495.

［47］Kamachi S，Mochizuki A，Nishiguchi M，et al.Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing ［J］.Plant Cell Reports，2007，26(8):1283-1288.

［48］Shimizu T，Yoshii M，Wei T，et al.Silencing by RNAi of the gene for Pns12，a viroplasm matrix protein of Rice dwarf virus，results in strong resistance of transgenic rice plants to the virus［J］.Plant Biotechnology Journal，2009，7(1):24-32.

［49］Zhang X，Sato S，Ye X，et al.Robust RNAi-based resistance to mixed infection of three viruses in soybean plants expressing separate shorthairpins from a single transgene ［J］.Phytopathology，2011，101(11):1264-1269.

［50］Zhou Y，Yuan Y，Yuan F，et al.RNAi-directed downregulation of RSV results in increased resistance in rice(Oryza sativa L.)［J］.Biotechnology Letters，2012，34(5):965-972.

［51］Thao N P，Chen L，Nakashima A，et al.RAR1 and HSP90 form a complex with Rac/Rop GTPase and function in innateimmune responses in rice ［J］.The Plant Cell Online，2007，19(12):4035-4045.

［52］Sindhu A S，Maier T R，Mitchum M G，et al.Effective and specificin planta RNAiin cystnematodes:expression interference of four parasitism genes reduces parasitic success［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60(1):315-324.

［53］Ibrahim H M M，Alkharouf N W，Meyer S L F，et al.Posttranscriptional gene silencing of root-knot nematode in transformed soybean roots ［J］.Experimental Parasitology，2011，127(1):90-99.

［54］Matsunaga Y，Kawano K，Iwasaki T，et al.RNA interferencemediated growth control of the southern root-knot nematode Meloidogyne incognita ［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2011，76(2):378-380.

［55］Huvenne H，Smagghe G.Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control:a review ［J］.Journal of Insect Physiology，2010，56(3):227-235.

［56］Gordon K H J，Waterhouse P M.RNAi for insect-proof plants［J］.Nature Biotechnology，2007，25(11):1231-1232.

［57］Price D R G，Gatehouse J A.RNAi-mediated crop protection against insects ［J］.Trends in Biotechnology，2008，26(7):393-400.

［58］Mao Y B，Cai W J，Wang J W，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol［J］.Nature Biotechnology，2007，25(11):1307-1313.

［59］Zha W，Peng X，Chen R，et al.Knockdown of midgut genes by dsRNA-transgenic plant-mediated RNA interferencein the hemipteran insect Nilaparvata lugens［J］.PLoS One，2011，6(5):e20504.

［60］Tabashnik B E，Gassmann A J，Crowder D W，et al.Insect resistance to Bt crops:evidence versus theory ［J］.Nature Biotechnology，2008，26(2):199-202.

［61］Ma L，Reinhardt F，Pan E，et al.Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model［J］.Nature Biotechnology，2010，28(4):341-347.

［62］Katoch R，Thakur N.Advances in RNA interference technology and its impact on nutritional improvement，disease and insect control in plants ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，169(5):1579-1605.