二甲亚砜对细胞色素P450酶3A4和2C9的影响

王彧杰 王媛媛 王 蓉 原永芳

上海交通大学医学院附属第三人民医院药剂科，上海 201999

二甲亚砜对细胞色素P450酶3A4和2C9的影响

王彧杰 王媛媛 王 蓉 原永芳

上海交通大学医学院附属第三人民医院药剂科，上海 201999

目的 研究0.01%、0.05%、0.1%二甲亚砜（DMSO）对细胞色素P450（CYP450）酶系中 3A4、2C9两个亚型基因及蛋白表达水平的影响。 方法Chang肝脏细胞经处理后，分为空白对照组（仅含培养液）、DMSO组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO 处理）、睾酮组（分别采用 1、10、100 μmol/L 睾酮处理）、利福平组（分别采用 1、10、100μmol/L利福平处理）、DMSO+睾酮组（分别采用 0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10 μmol/L 睾酮处理）、DMSO+利福平组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平处理）。利用逆转录定量PCR的方法，测定CYP3A4、CYP2C9基因水平的表达。利用蛋白免疫印迹法，测定CYP3A4、CYP2C9蛋白水平的表达。结果0.1%DMSO组CYP3A4mRNA高于空白对照组 （P＜0.01），且0.1%DMSO组CYP3A4蛋白的表达也高于空白对照组。0.01%、0.05%DMSO组CYP3A4mRNA表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但0.01%、0.05%DMSO组CYP3A4蛋白的表达高于空白对照组。0.01%、0.05%、0.1%DMSO组CYP2C9mRNA表达与空白对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），0.01%、0.05%、0.1%DMSO组CYP2C9蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。0.01%、0.05%DMSO+10μmol/L睾酮组CYP3A4mRNA的表达与空白对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），但 0.01%、0.05%DMSO+10μmol/L睾酮组 CYP3A4蛋白的表达高于睾酮组。0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平组CYP2C9 mRNA的表达与利福平组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平组CYP2C9蛋白的表达高于利福平组。 结论 0.01%、0.05%、0.1%三个浓度的DMSO在体外肝细胞实验中对CYP3A4的表达有一定的影响，而对CYP2C9的表达影响不明显，当DMSO作为药物溶剂的时候，可能会影响药物单用时的实验结果。

二甲亚砜；细胞色素P450酶3A4；细胞色素P450酶2C9；药物代谢；相互作用

在药物肝脏代谢中，细胞色素P450酶（CYP450）是与相关底物结合后活化或消除的重要药物代谢酶。其中CYP3A4含量最高，约占30%；CYP2C9约占12.8%，是主要的药物代谢酶[1]。150多种药物可以通过CYP3A4或CYP2C9介导代谢，包括激素、免疫抑制剂、钙离子通道阻滞剂、非甾体抗炎药、抗菌药物等。因此，研究药物对CYP3A4、CYP2C9表达的影响非常重要。现在许多研究常选用肝脏细胞研究药物对CYP450酶的影响。在体外实验中，二甲亚砜（DMSO）是一种常用的药物溶剂。因其具有一个亲水的亚硫酰基和两个疏水的甲基，所以DMSO既可溶解极性化合物也可溶解非极性化合物，可提高许多药物的溶解度而在实验中被广泛使用。通常认为低浓度DMSO对细胞无毒性，不影响实验结果。然而，近年来的实验研究发现1%浓度的DMSO会影响干细胞的分化[2]；0.5%的DMSO影响耳蜗器官培养[3]；0.01%的DMSO抑制肝微粒体中P450 1A2的体外检测[4]。此外，DMSO对CYP450酶也有影响：瑞士学者发现DMSO可上调HepaRG细胞中 CYP1A2、2B6、2C9和 3A4的表达[5]。但日本学者曾报道DMSO可抑制CYP2C9、CYP2C18基因的表达[6]。因此，本研究将考察不同浓度DMSO对肝细胞中CYP3A4和2C9表达的影响，以助于选择合理的DMSO浓度用于体外细胞实验，降低DMSO作为溶剂对体外细胞实验结果的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Chang Liver细胞（中国科学院细胞库），RPMI 1640培养基（GIBCO公司），胎牛血清（天杭生物科技有限公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），青-链霉素（Millpore公司），睾酮（Sigma 公司），利福平（Sigma 公司），RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司），苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技术有限公司），蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司），CYP3A4抗体（Chemicon公司），CYP2C9抗体（Abcam公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体IgG（鼎国生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠抗体IgG（威奥生物技术有限公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（GAPDH，Bioworld 公司），预染蛋白 Marker（Thermo 公司），DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（Milipore公司），Trizol（Invitrogen 公司），RNA 逆转录试剂盒（TaKaRa公司），SYBR-标记定量PCR试剂盒（TaKaRa公司），100bp DNA ladder（鼎国昌盛生物有限公司）。

恒温CO2培养箱（美国Thermol公司），超微量分光光度仪（美国NanoDrop公司），酶标仪（美国Bio-RAD公司），Veriti®PCR热循环仪 （美国Life Technologies公司），7500实时荧光定量PCR系统（美国Life Technologies公司），凝胶图像分析系统（法国Vilber公司），蛋白电泳转印仪（美国Bio-RAD公司），低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 细胞培养

Chang Liver细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS）、1%青-链霉素的 RPMI 1640 培养液内，37°C，5%CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数期生长细胞用于各项实验。

1.3 药物处理及分组

选择睾酮作为CYP3A4诱导剂，选择利福平作为CYP2C9诱导剂，设定以下分组：空白对照组：细胞仅给予RPMI1640培养液；DMSO处理组（分别采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO处理）；睾酮处理组（分别采用1、10、100μmol/L睾酮处理），利福平处理组（分别采用1、10、100 μmol/L 利福平处理）。（0.01%、0.05%、0.1%）DMSO+10μmol/L 睾酮组，（0.01%、0.05%、0.1%）DMSO+10μmol/L利福平组。每组各3个样品。

1.4 定量PCR法检测CYP3A4、CYP2C9mRNA表达

Chang Liver细胞接种于细胞培养皿中，接种密度1×106/mL，在 37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞单层贴壁生长至70%～80%时，加入上述不同药物处理细胞，培养24 h。培养结束后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后，加入Trizol试剂提取细胞总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度及A260/A280值，当A260/A280＞1.8时，证明纯度较高。根据TaKaRa逆转录试剂盒说明书，将RNA反转录为cDNA。以cDNA作为RT-PCR的反应模板，根据TaKaRa定量PCR试剂盒说明书，配制反应液进行实时定量PCR反应，反应条件如下：95℃预变性 30 s，PCR 反应 95℃ 5 s，60℃34 s，循环数为40次，测定融解曲线，通过Ct值计算相对表达量[7]。以GAPDH为内参，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。本实验以GAPDH作为内参照，所有基因表达都以GAPDH作均一化处理。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 W estern blot方法检测蛋白表达

细胞接种于培养皿中，分别加入不同的药物处理24 h后，用PBS清洗细胞3次，使用含有PMSF的蛋白裂解液裂解细胞，操作均在冰上进行，收集各组细胞裂解产物，加入1/4体积的上样缓冲液，涡旋混匀，在100°C水浴中煮沸10min使蛋白变性。配制5%浓缩胶、10%分离胶，根据蛋白浓度决定加样量。浓缩胶用电压100 V电泳，当样品浓缩为一条直线改用150 V电压，约70 min后停止电泳。取下凝胶100 V转膜120min，TBST室温封闭2 h。加入一抗，CYP3A4（1∶2000）、CYP2C9（1∶2000），GAPDH （1∶5000），4℃ 摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入1∶2000稀释的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次；化学发光试剂显色发光，以GAPDH蛋白作为内参，蛋白表达都以GAPDH作均一化处理。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据管理和统计分析。定量PCR中所有数据均以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。分析前均进行方差齐性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMSO对CYP3A4、CYP2C9mRNA表达的影响

定量PCR获得的样品Ct值，经倍数转换后，与空白对照组（1.00±0.06）比较，0.01%、0.05%的 DMSO[（1.00±0.18）、（1.24±0.11）]对 Chang 肝细胞中 CYP3A4 mRNA的表达几乎没有影响，而与空白对照组比较，0.1%的 DMSO（4.03±1.03）可明显诱导 CYP3A4mRNA的表达（P＜0.01）。见图 1。

图1 不同浓度二甲亚砜对CYP3A4 m RNA的影响

以同样的方法测定不同浓度DMSO对CYP2C9 mRNA的影响，结果发现：与空白对照组（1.05±0.39）比较，0.01%、0.05%、0.1%的 DMSO[（1.29±0.25）、（1.12±0.43）、（1.83±1.03）]对 Chang 肝细胞中 CYP2C9mRNA的表达几乎没有影响（P＞0.05）。见图2。

图2 不同浓度二甲亚砜对CYP2C9 mRNA的影响

2.2 DMSO对CYP3A4、CYP2C9蛋白表达的影响

与空白对照组比较，0.01%、0.05%的 DMSO对Chang肝细胞中CYP3A4蛋白的表达几乎没有影响，而0.1%的DMSO可明显诱导CYP3A4蛋白的表达。见图3。

图3 DMSO对CYP3A4蛋白表达的影响

与空白对照组比较，0.01%、0.05%、0.1%的DMSO对Chang肝细胞中CYP2C9蛋白的表达几乎没有影响。见图4。

图4 DMSO对CYP2C9蛋白表达的影响

2.3 DMSO与药物联合使用对 CYP3A4、CYP2C9 mRNA表达的影响

与空白对照组（1.03±0.33）比较，0.01%、0.05%、0.1%的 DMSO＋10 μmol/L 睾酮组[（1.65±0.32）、（0.64±0.24）、（1.28±0.27）]Chang 肝细胞 CYP3A4 mRNA 的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组比较，10、100 μmol/L 的睾酮[（3.20±0.23）、（2.13±0.03）]能够显著上调CYP3A4mRNA的表达（P＜0.01）。见图5。

图5 二甲亚砜与睾酮联合使用对CYP3A4 mRNA表达的影响

与空白对照组（1.02±0.29）比较，1、10、100 μmol/L的利福平[（0.93±0.11）、（1.30±0.76）、（1.02±0.15）]，以及 0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋利福平组[（0.70±0.17）、（2.77±1.63）、（0.88±0.53）]Chang 肝细胞 CYP2C9mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与10μmol/L利福平比较组，0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋利福平组Chang肝细胞CYP2C9 mRNA的差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见图 6。

图6 二甲亚砜与利福平联合使用对CYP2C9 m RNA表达的影响

2.4 DMSO与药物联合使用对CYP3A4、CYP2C9蛋白表达的影响

与空白对照组比较，单用睾酮可诱导Chang肝细胞CYP3A4蛋白的表达。但当睾酮中分别加入0.01%、0.05%DMSO可使CYP3A4的蛋白表达显著上升。见图7。

图7 DMSO与睾酮联合使用对CYP3A4蛋白表达的影响

与空白对照组相比，单用利福平对Chang肝细胞CYP2C9蛋白的表达的影响较小，但当利福平中分别加入0.01%、0.05%、0.1%DMSO均使CYP2C9的蛋白表达显著上升，见图8。

图8 DMSO与利福平联合使用对CYP2C9蛋白表达的影响

3 讨论

DMSO是体外细胞实验中经常使用的药物溶剂，常用的浓度为0.1%，普遍认为该浓度下的DMSO对实验结果的影响小。然而本实验研究发现0.1%甚至更低浓度DMSO能够影响Chang肝细胞中CYP3A4和CYP2C9的表达。以往研究也发现2.5%的DMSO可提高人肝脏细胞CYP3A4 mRNA的表达[8]。DMSO可通过以下途径对CYP3A4 mRNA诱导性表达和构成性表达产生影响：DMSO可增强CYP3A4mRNA启动子——孕烷活化受体（PXR）的表达[9]，从而增强其诱导性表达。增强其构成性表达是通过激活激活蛋白（activator protein，AP-1）[10]，进一步激活构成性肝增强子模块4（CLEM4）；并且促进CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）修复[9]，而增强其调控。本实验进一步证实了0.1%DMSO可使肝脏细胞CYP3A4 mRNA和蛋白的表达升高。

但是本实验中发现，DMSO在与睾酮联合使用时，在基因水平上未见其上调CYP3A4mRNA作用，这可能是由于DMSO抑制了6β羟化睾酮的活化，从而抑制了CYP3A4mRNA的表达。而在蛋白水平上DMSO与睾酮联合使用后可提高CYP3A4蛋白的表达。其原因可能是DMSO抑制了CYP3A4蛋白的代谢，也可能是DMSO增加了细胞膜的通透性，使细胞内睾酮的浓度升高，从而诱导了CYP3A4的蛋白表达。

本实验还发现，0.01%、0.05%、0.1%DMSO对CYP2C9 mRNA和蛋白的影响相对较小。CYP2C9转录调控受到5'端启动子区孕烷活化受体（PXR）[11]、构成性雄烷受体（CAR）[12]、维生素 D 受体（VDR）[13]、糖皮质激素受体（GR）[14]等的识别，而核肝因子 4（HNF4）[15]、核肝因子3γ（HNF3γ）[16]参与 CYP2C9 的转录。 只有当药物反应性核受体、核肝因子、共激活因子等共同作用才能最大程度地激活CYP2C9基因[17]。然而DMSO除对PXR的影响可见于文献报道外，对其他因子的影响均未见报道。因此仅对PXR的作用可能不足以启动CYP2C9的基因转录。从药物合用结果来看，单用DMSO对肝细胞CYP2C9无显著影响。然而当合用利福平后，CYP2C9蛋白表达明显升高，这可能与DMSO增加细胞膜的通透性，使胞内药物浓度提高有关。相关机制有待进一步研究。

综上所述，0.01%、0.05%、0.1%三个浓度的DMSO在体外肝细胞实验中对CYP3A4的表达有一定的影响，而对CYP2C9的表达影响不明显；当DMSO作为药物溶剂的时候，可能会影响药物单用时的实验结果。因此，在进行相关药物代谢酶的研究时，应考虑DMSO对实验结果的影响。

[1]Zanger UM，Schwab M.Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism:regulation of gene expression，enzyme activities，and impact of genetic variation [J].Pharmacology&Therapeutics，2013，138（1）：103-141.

[2]PalR，MamidiMK，DasAK，etal.Diverseeffectsofdimethyl sulfoxide（DMSO）on the differentiation potential of human embryonic stem cells[J].ArchivesofToxicology，2012，86（4）：651-661.

[3]QiW，DingD，SalviRJ.Cytotoxiceffectsofdimethylsulphoxide（DMSO）on cochlear organotypic cultures[J].Hearing Research，2008，236（1-2）：52-60.

[4]NirogiR，KandikereV，BhyrapuneniG，etal.Effectofdimethyl sulfoxide on in vitro cytochrome P4501A2 mediated phenacetin O-deethylation in human livermicrosomes[J].Drug Metabolism and Disposition：the Biological Fate of Chemicals，2011，39（11）：2162-2164.

[5]KanebrattKP，Andersson TB.Evaluation ofHepaRG cellsas an in vitro model for human drug metabolism studies[J].Drug Metab Dispos，2008，36（7）：1444-1452.

[6]Sumida K，Igarashi Y，Toritsuka N，et al.Effects of DMSO on gene expression in human and rat hepatocytes[J].Human&Experimental Toxicology，2011，30（10）：1701-1709.

[7]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[8]Nishimura M，Ueda N，Naito S.Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms，UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms，and ABCB1 in primary culture ofhuman hepatocytes[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin，2003，26（7）：1052-1056.

[9]Su T，Waxman DJ.Impact of dimethyl sulfoxide on expression of nuclear receptors and drug-inducible cytochromes P450 in primary rat hepatocytes[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2004，424（2）：226-234.

[10]Wang CC，Lin SY，Lai YH，et al.Dimethyl sulfoxide promotes the multiple functions of the tumor suppressor HLJ1 through activator protein-1 activation in NSCLC cells[J].PloSone，2012，7（4）：e33772.

[11]Chen Y，Ferguson SS，Negishi M，et al.Induction of human CYP2C9 by rifampicin，hyperforin，and phenobarbital ismediated by the pregnane X recepto[J].JPharmacol Exp Ther，2004，308（2）：495-501

[12]Ferguson SS，LeCluyse EL，Negishi M，et al.Regulation of human CYP2C9 by the constitutive androstane receptor：discovery of a new distal binding site [J].Mol Pharmacol，2002，62（3）：737-746.

[13]Drocourt L，Ourlin JC，Pascussi JM，et al.Expression of CYP3A4，CYP2B6，and CYP2C9 is regulated by the vitamin D receptor pathway in primary human hepatocytes[J].JBiol Chem，2002，277（28）：25125-25132.

[14]Gerbal-Chaloin S，DaujatM，Pascussi JM，etal.Transcriptional regulation of CYP2C9 gene.Role of glucocorticoid receptor and constitutive androstane receptor[J].JBiol Chem，2002，277（1）：209-217.

[15]Chen Y，Kissling G，NegishiM，et al.The nuclear receptors constitutive androstane receptor and pregnane X receptor cross-talk with hepatic nuclear factor 4alpha to synergistically activate the human CYP2C9 promoter[J].JPharmacol Exp Ther，2005，314（3）：1125-1133.

[16]Bort R，Gomez-Lechon MJ，Castell JV，etal.Role of hepatocyte nuclear factor 3 gamma in the expression of human CYP2C genes[J].Arch Biochem Biophys，2004，426（1）：63-72.

[17]Chen Y，Goldstein JA.The transcriptional regulation of the human CYP2C genes[J].Current Drug Metabolism，2009，10（6）：567-578.

Effects of Dimethyl Sulfoxide on Cytochrome P450 3A4 and 2C9

WANGYujieWANGYuanyuanWANGRongYUANYongfang
Department of Pharmacy,the Third People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 201999,China

ObjectiveTo investigate effects of 0.01%,0.05%,0.1%dimethyl sulfoxide (DMSO)on expression of CYP3A4 and CYP2C9 mRNA and protein.M ethods Chang liver cells were divided into control group (dealed with RPMI-1640 singly),DMSOgroups(dealedwith 0.01%,0.05%,0.1%DMSO),testosteronegroups(dealed with 1,10,100μmol/L testosterone),rifampicin groups(dealed with 1,10,100μmol/L Rifampicin),DMSO+testosterone groups(0.01%,0.05%,0.1%DMSO+10μmol/L testosterone)and DMSO+rifampicin groups(dealed with 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+10μmol/L Rifampicin).The expression of CYP3A4 and CYP2C9 mRNA were detected by RT-qPCR,and the expression of CYP3A4 and CYP2C9 protein were detected by Western blot.Results Compared with control group,the expression of CYP3A4mRNA and protein was increased by 0.1%DMSO (P＜0.01);the expression of CYP3A4 protein could be induced by 0.01%and 0.05%DMSO,but no statistically significant difference on CYP3A4mRNA (P＞0.05).Compared with control group,there was no statistically significant difference on the expression of CYP2C9 mRNA and protein in DMSO groups(P＞0.05).Compared with control group,there was no statistically significant difference on the expression of CYP3A4mRNA in DMSO+testosterone groups(P＞0.05).Compared with testosterone group,the expression of CYP3A4 protein was induced in 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+testosterone group.Compared with rifampicin group,the expression of CYP2C9 protein was increased in 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+Rifampicin group,but no statistically significant difference on CYP2C9 mRNA (P＞0.05).Conclusion The efficiency of 0.01%,0.05%and 0.1%DMSO is greater on CYP3A4 than CYP2C9 in vitro test.0.01%,0.05%,0.1%DMSO can influence expression of CYP3A4,but have poor effect on expression of CYP2C9 in vitro.DMSO as solvent can influence results of experiment.

Dimethyl Sulfoxide;CYP3A4;CYP2C9;Drugmetabolism;Drug interaction

原永芳，女，博士，主任药师，博士研究生导师，主要从事药代动力学以及药物分子机制方面的研究。

R966

A

1673-7210（2014）12（c）-0004-05

国家自然科学基金资助项目（编号81373375）。

2014-09-19 本文编辑：苏 畅）