DNA甲基化在眼科疾病中的应用以及中药调节甲基化的研究进展

吴文婷 金 明

2003年，伴随着为期5年的人类表观基因组计划（Human Epigenome Project,HEP）正式启动，医学界将目光投向DNA甲基化在人类及其他生物的生理状态以及疾病谱的作用的系统研究方面。经过10年来的迅猛发展，DNA甲基化调节已经成为当今研究热点，为阐明疾病的发病机制提供了帮助，大量文献证实特定基因DNA甲基化状态的异常与眼科疾病密切相关。表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下，基因的表达与功能发生改变并产生可遗传的表型。DNA甲基化（DNA methylation）作为一种表观遗传学的重要机制，是指由DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化 S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作为甲基供体，将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的反应，此调节在生命活动中发挥重要的作用〔1〕。目前，一些与表观遗传学相关的药物正在临床试验中，以期能找到调节表观遗传基因组的药物而达到治疗疾病的目的。而前期文献表明，在胃癌、糖尿病肾病、硬皮病、抗衰老等方面，传统中医药显示了不可小觑的DNA甲基化调节作用。虽然其在眼科领域的治疗还为一片空白，但有理由相信中药具有通过调节甲基化方面的途径治疗眼科疾病的前景。

1 甲基化在眼科疾病中的应用

1.1 葡萄膜恶性黑色素瘤

1.1.1 RASEF基因：RASEF位于9q21，与葡萄膜、皮肤黑色素瘤相关，起到抑癌基因的作用。Matt〔2〕等以11份葡萄膜黑色素瘤细胞株和35份葡萄膜黑色素瘤组织为研究样本，用高分辨率熔化曲线及消化分析筛选RASEF变异，RT-PCR测定RASEF表达，基因测序观察RASEF基因启动子甲基化状态。结果表明RASEF启动子甲基化缺失，伴随RASEF高表达，且RASEF基因的甲基化与存活率的减少存在关联。说明葡萄膜黑色素瘤中抑癌基因启动子甲基化是导致抑癌基因表达沉默、癌症发生的原因。

1.1.2 hTERT基因：端粒的长短在染色体稳定、细胞生长及衰老方面发挥重要的作用，端粒酶活性异常可使肿瘤细胞具有无限分裂的能力而发生癌变，人催化亚基端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶的限速成分，与端粒酶活性相关，可催化TTAGGG重复序列至染色体末端的端粒，保证染色体在多次复制后，不会被降解〔3〕。Moulin〔4〕等采用甲基化敏感性单链构象分析（methylationspecific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）和斑点免疫印迹法，对23例原发葡萄膜黑色素瘤的DNA进行相关基因启动子甲基化状态的研究，发现hTERT基因启动子甲基化的比例为52%。

1.1.3 RASSF1A基因：该基因坐落于3号染色体p21.3区，其编码的蛋白与DNA修复蛋白XPA相互作用，抑制细胞周期蛋白D1的积累，从而阻滞细胞周期循环。Merhavi〔5〕等采用亚硫酸钠修饰后甲基化PCR技术对20份原发性葡萄膜黑色素瘤样本进行研究，发现RASSF1A基因启动子区存在高甲基化状态改变，同时与肿瘤相关的BRAF基因变异缺失，说明此肿瘤形成中表观调节占有重要地位，即抑癌基因启动子高甲基化的表观调节可能是葡萄膜黑色素瘤的形成机制。

1.1.4 TIMP3 基因：van der Velden〔6〕将原发性葡萄膜黑色素瘤细胞系和伴肝转移的细胞系对比研究，采用microarray分析1 176个基因，发现了63个表达异常的基因。再以甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-dC）去甲基化处理原发性葡萄膜黑色素瘤细胞系，发现有19个基因因高甲基化存在表达抑制。其中，金属蛋白酶组织抑制物-3（tissue metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）由 TIMP3 编码，其蛋白产物是参与细胞外基质降解的因子之一，因其DNA高甲基化异常状态而导致相应蛋白在转移组织中的表达量下降5倍，表明TIMP3在葡萄膜黑色素瘤的发生，甚至是转移中发挥重要作用。

1.1.5 p16（INK4a）基因：也被称为 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A（CDKN2A），为重要的细胞周期依赖性激酶抑制基因，该基因失活可导致细胞G1-S期功能失常，表现为细胞无限制增长，即肿瘤。van der Velden〔7〕发现，在50%的葡萄膜黑色素瘤细胞系以及32%的原发性葡萄膜黑色素瘤中，p16（INK4a)的启动子存在高甲基化改变，相应蛋白的表达缺失，且伴随甲基化异常的肿瘤患者死亡率较高。使用5-Aza-dC去甲基化处理样本后，p16（INK4a）mRNA恢复表达，说明在葡萄膜黑色素瘤中，启动子的高甲基化导致p16基因表达沉默，甲基化抑制后该基因可重新表达。

1.1.6 CXCR4基因：趋化因子受体CXCR4在体内大部分组织和器官上都有表达，它是由352个氨基酸组成的G蛋白偶联受体（GPCR），参与体内多种生理机制，如肿瘤迁移等〔8〕。Li〔9〕等为了验证CXCR4启动子区甲基化状态与葡萄膜黑色素瘤肝脏转移之间的关系，将LS174T克隆肿瘤细胞注射入免疫缺陷小鼠的前房、皮下、脾脏内等诱发肝转移，检测发现前房起源的的LS174T肿瘤细胞的CXCR4的表达量相较于其他组和野生型低，其启动子区（～2660 bp～2671 bp）的DNA几乎完全甲基化，同时甲基转移酶活性增高，在加入5-AzadC后，LS174T细胞的CXCR4恢复表达。

1.1.7 TRAIL 受体基因：TRAIL R1-R4（也被称为 DR4、DR5、DcR1、DcR2）是最主要的4个人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,TRAIL）的受体。有文献表明，DR4启动子区甲基化可降低葡萄膜黑色素瘤对干扰素介导的凋亡作用的敏感性〔10〕，DcR2在黑色素瘤中蛋白表达沉默〔11〕。 Venza〔12〕等以皮肤、葡萄膜黑色素瘤细胞系以及病理组织为样本，进行TRAIL受体的启动子甲基化状态等方面的观察。结果表明，在皮肤、葡萄膜黑色素瘤的样本中，DR4、DR5、DcR1和 DcR2的 DNA启动子区皆存在明显异常，但只有DcR1和DcR2的甲基化异常与蛋白表达有相关性，且用5-Aza-dC调节后，蛋白可重新表达。实验还表明，DNMT1活性与DcR2的高甲基化有关，而DNMT1和DNMT3a共同调节DcR1启动子区的的甲基化状态。

1.2 视网膜母细胞瘤

1.2.1 RASSF1A基因：Cohen〔13〕等对 19例视网膜母细胞瘤样本亚硫酸氢钠处理后以实时定量甲基化特异性PCR方法进行启动子甲基化状态的研究，发现与肿瘤相关的RASSF1A的甲基化率为89%。

1.2.2 Rb2/p130基因：Rb2/p130是与视网膜母细胞瘤相关的抑癌基因之一，由3853个核苷酸构成，含有22个外显子，位于16q12.2。Rb2/p130可介导与细胞蛋白如转录因子E2F、细胞周期蛋白或依赖性激酶相互作用，维持G0期细胞的转录静止，其基因的突变、缺失与许多恶性肿瘤的发生密切相关〔14〕。Tosi〔15〕等对10例视网膜母细胞瘤研究发现，伴随外显子1突变，Rb2/p130启动子CpG区出现甲基化改变，并决定了疾病的表型。用甲基化抑制剂5-Aza-dC处理后，Rb2/p130基因表达水平上升。

1.2.3 MGMT 基因 ：O6-methylguanine DNA methyltransferase（MGMT）基因位于染色体的10q26，为维持基因组的稳定性发挥了重要作用。它可以修复并还原发生甲基化修饰的鸟嘌呤，避免DNA在复制及转录时发生错配及误差。Choy〔16〕等采用23份视网膜母细胞瘤标本和2份视网膜母细胞瘤细胞株（Y79 and WERI-Rb1）进行与肿瘤相关基因的甲基化状态的研究。结果表明35%的病理组织中可检测到至少1处以上的MGMT区的高甲基化，相应蛋白表达缺失，且该情况在低组织分化的瘤体中更常见。从以上推测出，MGMT基因启动子甲基化后导致MGMT蛋白表达缺失与视网膜母与视网膜母细胞瘤的发生发展紧密相关。

1.3 年龄相关性黄斑变性（AMD）

1.3.1 IL-17RC基因：美国NIH的Wei〔17〕采用甲基化免疫共沉淀芯片技术测定（MeDIP-chip）对3对同卵双胞胎（其中一个患有AMD，另一人健康）进行研究，发现AMD患者IL-17RC基因启动子CpG区域存在DNA低甲基化改变。这一结论在多中心收集的大样本AMD患者中得到验证。且相较于正常人，IL-17RC在AMD患者的视网膜、脉络膜组织中高表达，揭示IL-17RC基因启动子DNA低甲基化以及蛋白高表达是AMD患者所特有的现象。IL-17RC以跨膜蛋白形式存在于细胞膜上，作为共受体与IL-17亚型特异性结合，激活炎症下游的多条信号转导通路，影响细胞因子等炎症相关基因的表达，促进炎症反应发生。IL-17还能上调血管内皮生长因子（VEGF）的水平〔18〕，增加 VEGF mRNA 的表达。 而 VEGF与肝细胞生长因子（HGF）的联合作用又可以提供正反馈信号，诱导IL-17RC增多〔19〕，放大了炎症链级反应，形成复杂的炎症分子网络。

1.3.2 GSTM1、GSTM5 基因：Hunter〔20〕等借助 Illumina 人类甲基化27平台，对AMD和健康对照者尸体的视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜进行DNA甲基化的区别检测，发现与年龄配对的健康人相比，AMD患者的GSTM1启动子区存在高甲基化改变，导致RPE、脉络膜以及神经感觉层的 GSTM1和GSTM5的蛋白明显降低，可能由此引发AMD患者视网膜的氧化应激损伤。

1.4 老年性核性白内障

CRYAA基因：CRYAA编码一种晶状体结构蛋白，对于保持晶状体透明有重要作用。Zhou〔21〕等对15例老年性核性白内障患者的晶状体上皮细胞研究发现，其启动子区CpG岛存在高甲基化改变，以及相应的转录水平、蛋白水平下调。用去甲基化试剂调节后，其表达恢复，提示老年性核性白内障晶状体上皮细胞存在表观遗传调控改变。

1.5 翼状胬肉

TGM2、MMP2、CD24 基因：Riau〔22〕等从翼状胬肉患者的病变处和正常结膜处取材，采用亚硫酸盐测序法比较了29种与基质重构、细胞黏附相关基因的甲基化状态异同。结果发现，谷氨酰胺转移酶2（TGM-2）基因有3个CpG位点发生高甲基化改变，基质金属蛋白酶2（MMP2）和CD24分别存在2个和4个CpG位点的低甲基改变，且转录和蛋白水平也发生了相应的调控变化。这3个基因的甲基化异常可导致成纤维细胞、新生血管的病变，从而引发翼状胬肉的形成。

随着表观遗传学研究的深入，相信在未来，越来越多的眼科疾病将会被证实与基因甲基化状态异常密切相关。利用基因测序，识别出正常和错误的表观基因组的组成和结构，为运用表观遗传学方法来治疗疾病奠定了基础。然而，表观基因调节药物仍处于前期开发阶段。众所周知，西药的研发周期长，需耗费大量的人力、资金，且结果也不一定乐观。但是，中医学有宝贵的天然药材，以及丰富的理论，通过数千年的经验传承，已经验证了临床有效性，值得后人努力挖掘和证实其现代中药药理作用，以更加科学、逻辑的方式去解读中药有效性。而现代中医研究者已经运用表观遗传学方法发现中药对DNA甲基化存在调控作用。虽然，目前中药调节DNA甲基化的作用在眼科领域鲜有报道，但是有理由认为中药具有通过调节甲基化而达到治疗相关眼病的可能，以下内容就中药在癌症、糖尿病肾病、硬皮病、抗衰老等方面调节DNA甲基化的研究进展进行论述，为其将来在眼科的应用提供基础。

2 中药调节DNA甲基化的研究进展

黄明明〔23〕等体外培养人胃癌SGC-7901细胞，用不同浓度（0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）白藜芦醇孵育48 h 后，采用甲基化特异性 PCR（MSP）、RT-PCR、Western blot检测RASSF1A基因启动子区域的甲基化改变情况、mRNA表达以及蛋白表达水平。结果显示白藜芦醇能以剂量依赖性方式抑制SGC-7901细胞增殖，随着浓度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐渐减弱，非甲基化水平逐渐增多。同时RASSF1A的mRNA和蛋白表达水平明显上调。提示白藜芦醇对甲基化水平的调节，可能是其抗癌的重要因素。

硬皮病是表观遗传异常的多基因疾病，致病关键环节受表观遗传调节〔24〕。齐庆〔25〕等体外培养建立硬皮病成纤维细胞系，并用补肾益精法含药血清干预后，发现补肾益精法可抑制硬皮病成纤维细胞I型胶原α2（Col1α2）、转化生长因子β（TGF-β）基因的表达，提高胶原抑制因子Fli1与Smad7的表达，同时可减少DNMT1的表达。补肾益精法源自广州中医药大学大学邓铁涛教授对硬皮病辨治经验的总结，能软化皮肤、改善纤维化表现。补肾益精法软皮汤方含熟地黄20 g，阿胶、山茱萸各10 g、黄芪、山药各30 g、红花5 g、茯苓15 g等。

郭维〔26〕证实，消痰散结方（主要由半夏、天南星组成）能够有效抑制胃癌细胞系以及裸鼠原位移植瘤的生长，其机制与逆转抑癌基因p16甲基化水平，增加p16 mRNA表达水平有关。

参茸补血丸由人参、鹿茸、杜仲、巴戟天等药组成，具有补肾填精、益气生血的功效，在临床中广泛应用。王蕾〔27〕等发现大鼠摘除卵巢后，雌激素分泌障碍，生殖器官萎缩，肝、肾组织甲基化酶活力、甲基化水平升高，对应组织RNA聚合酶活力明显降低，处于低表达；参茸补血丸大、小剂量组大鼠子宫和阴道组织结构与模型组对比有明显改善，甲基化酶活力、甲基化水平呈规律性剂量依赖性低下，RNA聚合酶活力明显提高。说明参茸补血丸能促进去势大鼠生殖器官的发育，分子机制之一可能是通过降低甲基化水平，提高RNA聚合酶活力，促进相关功能基因表达来实现的。

汪琛颖〔28〕等以糖尿病大鼠为模型，观察中药糖维康治疗糖尿病肾病的分子机制。其从糖尿病肾病大鼠的胰组织中提取基因组DNA，用甲基化敏感性限制性核酸内切酶HpaII和MspI（为一组同裂酶）进行限制性酶切，并进行染色质DNaseI敏感性分析。研究表明糖维康（太子参、黄芪、玄参、丹参、僵蚕、水蛭等）治疗后能向正常方向逆转胰组织DNA中CCGG位点甲基化状态，通过提高基因转录水平和向正常方向恢复甲基化状态而发挥其治疗作用。

林一萍〔29〕等研究表明益肾健脾方剂能明显提高生理性肾虚小鼠肝细胞甲基转移酶的活性，机制可能是通过改变DNA甲基转移酶空间构象，使它更容易向正常的甲基化位点转移甲基，为从分子生物学的角度探讨中医益肾健脾延缓衰老的机理提供了客观依据。

通过以上文献的分析，中药主要是在肿瘤领域发挥其DNA甲基化状态调节作用，通过对甲基化水平的调控，进一步促进抑癌基因表达，降低肿瘤细胞的存活率，从而影响了疾病的发展，相信其调节作用也能应用于葡萄膜恶性黑色素瘤和视网膜母细胞瘤等眼科疾病。此外，对于目前具有调节甲基化作用的中药进行总结，发现多属于补肾填精、益气健脾活血、化痰散结等方面。根据中医“同病异治”、“异病同治”的经典理论，以上治疗法则也在眼科中广泛运用，且都收效甚好。表观遗传学方法的出现，为中药有效性的研究提供了新的方法。

3 展望与挑战

DNA甲基化在脊椎动物的生命活动中起重要的调节作用，参与个体发育和细胞分化的过程。与基因序列改变不同，表观遗传学修饰是可逆的，这无疑为治疗找到了新的突破口。相信随着研究的深入，在不久的将来，其在眼科疾病研究中的作用会越来越重要。此外，应大力开展中药有效性的研究，以期能在调节DNA甲基化方面发挥重要作用，更好地服务于临床。

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