Array-CGH技术在产前诊断不平衡染色体改变中的应用

宫玉典刘文娟

（1烟台市心理康复医院，山东 烟台265200；2烟台市莱阳中心医院，山东 烟台 265200）

Array-CGH技术在产前诊断不平衡染色体改变中的应用

宫玉典1刘文娟2

（1烟台市心理康复医院，山东 烟台265200；2烟台市莱阳中心医院，山东 烟台 265200）

Array-CGH技术；产前诊断；染色体不平衡；应用

随着全球污染的逐渐加重，越来越多的新生儿出生时带有遗 传基因缺陷。我国存在出生缺陷的新生儿人数占总出生人数的5%左右，近几年出生缺陷发生率在逐年增加[1]。染色体不平衡畸变，其是导致人类先天性畸变最重要也是最常见的原因，其发病率占先天疾病发病率的20%左右[2]。Array-CGH的主要原理是将待测DNA与对照DNA使用不同荧光的生物素标记，二者等量混合，使用足量的人Cot-1DNA抑制分散重复序列，将混合物杂交于微阵列芯片上，微阵列中包括全基因组DNA，当待测DNA存在片段缺失时，对照DNA先与微阵列上的全基因组DNA结合，当DNA存在片段扩增时，待测DNA先与全基因组DNA结合，当待测片段既不存在缺失也不存在扩增，即DNA片段平衡时，对照DNA与待测DNA与全基因组DNA竞争性结合，收集结合的荧光信号，将荧光信号使用分析软件处理[3]。对染色体不平衡的产前检查可以有效降低出生缺陷率，改善妊娠结局，目前不平衡染色体的产前检查手段主要有G显带核型分析，荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），光谱核型分析技术（spectral karyotyping，SKY）等，但这些技术的检出率低，漏查率高，本研究使用Array-CGH技术对不平衡染色体进行产前检查，期望寻找到准确，有效，方便的不平衡染色体产前检测技术。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2012年7月至2013年7月在我院行染色体检查的18例产妇，其中染色体核型正常产妇4例，疑似染色体异常病例14例，其中G显带核型分析提示染色体异常但未检测出染色体大片段不平衡畸变的病例8例，G显带核型分析未提示染色体微小片段不平衡畸变的病例6例。

1.2 方法

1.2.1 Array-CGH技术检测

样品准备：提取病例外周血及羊水基因组DNA样品，使用NSPⅠ限制性内切酶消化2 h，使用T4 DNA连接酶连接接头3 h。底物使用PCR进行扩增，PCR扩增条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，60.0 ℃45 ℃，72 ℃ 1 min45s，35循环，72 ℃ 10 min。使用磁珠吸附法纯化PCR扩增产物，使用末端转移酶在提纯的DNA产物末端标记生物素，并将DNA变性。探针变性：将标记的样本加入杂交液混匀，变性10 min制成DNA探针。将探针加入芯片中50 ℃反应24 h。洗涤和染色：将杂交后的芯片使用洗涤液清洗，并使用SAPE染色液进行染色，之后加入生物素标记的羊抗链酶亲和素抗体与探针结合。结果分析：使用Genotyping Console及GCOS软件进行信号扫描与信号强度分析。

1.2.2 荧光原位杂交技术检测验证

标本制备：使用常规方法制备染色体标本，室温放置备用。标本变性，将标本放入65 ℃预热的70%甲酰胺中2 min变性，将变性后的标本放入70%、90%、100%的乙醇中进行梯度脱水各2 min，之后将样本取出，室温放置晾干。探针变性：将生物素标记的探针70 ℃水浴变性10 min，再使用水浴退火。杂交：将变性后的探针加于变性后的DNA样本玻片之上，加盖玻片进行封片，将样本置于37 ℃环境中过夜。洗涤：将样本置于SSC液中5 min中，再使用50%甲酰胺洗涤2次，每次5 min，使用SSC液洗涤2次，每次5 min。将抗体加在样本玻片上，37 ℃孵育20 min，使用SSC洗涤3次，每次5 min。在样品玻片上加入DAPI封片液封片。结果检测：使用荧光显微镜观察样本。

1.3 数据统计

本研究数据应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。计量采用均数土标准差（）表示，使用方差分析（One-way ANOVA）分析各组组间差异，计数资料使用卡方检验进行比较，均以P＜0.05作为具有显著性差异。

2 结 果

2.1 Array-CGH检测结果

对25例患者进行array-CGH分析，确诊14例G显带核型分析未能明确诊断的染色体不平衡畸变，其中染色体微缺失6例，染色体大片段缺失2例，染色体片段重复3例，片段重复合并缺失的3例。

2.2 Array-CGH检测结果与G显带核型分析检测结果对比

患者中有4例G显带核型分析未能明确诊断的染色体不平衡畸变。病例1：G显带核型结果为46，XY，r（11）（q9q34？），array-CGH结果为46，XY del（11）（q33.2-q34）。病例1 G显带结果未能明确染色体发生缺失时染色体的断裂位点与缺失片段长度，array-CGH结果显示病例11号染色体的长臂发生缺失，其位置为正常片段的105239475-117459863bp。病例2：G显带核型结果为46，XY，add（13）（q10？），array-CGH结果为46，XY dup（13q11.3-q21.3）。病例2 G显带结果未能明确染色体发生畸变的片段，array-CGH结果显示病例13号染色体发生片段自身重复，其位置为正常片段的46825793-86359724bp。病例3：G显带核型结果为46，XY，add（11）（p11？），array-CGH结果为46，XY，dup（11）（p20.4-p10.4），del（11）（p21.6-p20.6）。病例3 G显带结果未能明确染色体发生不平衡畸变的模式，array-CGH结果显示病例11号染色体发生重复合并缺失的染色体不平衡畸变，其中，重复片段位置为正常片段的21365947-36594219bp，缺失片段位置为正常片段位置69548271bp-78426921bp。病例4：G显带核型结果为46，XY，add（8）（q11？），pat，array-CGH结果为46，XY ，dup（8）（8q11-q21）。病例4 G显带结果未能明确染色体发生自身重复的位点与缺失片段长度，array-CGH结果显示病例8号染色体的长臂发生自身重复，其位置为正常片段的26354985bp-59687125bp。

3 讨 论

目前不平衡染色体的产前检查手段主要有G显带核型分析，FISH，SKY等，但这些技术存在缺陷，降低了不平衡染色体产前检查的准确性。如G显带核型分析对染色体微小片段结构异常的分辨率差，如对5Mb以下的染色体结构异常的检出率为30%左右，漏诊率可高达70%左右。FISH对染色体数目异常的检测准确度高，但对染色体结构异常的检测准确度低。SKY的不足之处是其无法显示染色体发生结构异常的物理位置。本研究array-CGH结果不仅明确了患者发生染色体畸变的类型，还确定了染色体结构发生异常的具体位置。Array-CGH可对染色体结构的异常做出明确诊断，为临床预计妊娠结局，并做出相应治疗提供依据。

[1] Vialard F,Molina Gomes D,Leroy N,et al.Array comparative genomic hybridization in prenatal diagnosis:another experience[J].Fetal Diagn Ther,2009,25(2):277-284.

[2] Law L W,Lau TK,Fung TY,et al.De nove 16p13.11 microdeletion identified by high-resolution array CGH in a fetus with increased nuchal translucency[J].BJOG,2009,116(2):339-343.

[3] Kashork CD,Theisen A,Shaffer LG.Prenatal diagnosis using array CGH[J].Methods Mol Biol,2008,444(1):59-69.

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：B

：1671-8194（2014）06-0051-02