抗草甘膦杂草检测方法的研究进展

杨浩娜， 柏连阳，2

(1.湖南农业大学农药研究所，湖南长沙 410128； 2.湖南省农业科学院，湖南长沙 410125)

草甘膦是美国孟山都公司于20世纪70年代研制出的一种广谱灭生性除草剂，可以防除一年生和多年生杂草。因为草甘膦理化性质稳定，具有内吸传导性、高效低毒、低残留等其他除草剂所不具备的优点，现已成为世界最主要的除草剂之一。我国自1980年开始生产草甘膦以来，逐渐成为全球生产和销售草甘膦的中心[1]，起初草甘膦在我国仅在果园使用，后来随着少耕免耕等耕作方式的改变和作物行间的定向保护性喷雾技术的发展[2]，使得草甘膦使用范围得到进一步扩大。草甘膦现在既广泛用于橡胶、桑、茶、果园等田地，也用于大豆、棉花、水稻、小麦等草本科农田。长期使用单一的除草剂必将加快杂草产生抗药性。草甘膦具有独特的作用方式和代谢机制，在土壤中残留量极低，使人们认为在田间不可能有杂草对草甘膦产生抗药性[3]。然而，1996年澳大利亚首次报道发现抗草甘膦瑞士黑麦草(Loliumrigidum)之后，越来越多的抗草甘膦杂草在世界范围内被发现，给草甘膦的应用带来了前所未有的挑战，引起了国内外专家的极大关注[3]。在国内，越来越多的杂草被发现对草甘膦产生抗药性，如广东省发现牛筋草对草甘膦产生抗性[4]，湖南省、浙江省发现小飞蓬对草甘膦产生抗性[5-6]等。因此，建立一套科学快速的抗草甘膦杂草检测方法，为杂草抗药性和农田施药指导等相关工作提供理论支撑意义深远。本研究总结归纳科学有效的抗草甘膦杂草检测方法，旨在为农田抗草甘膦杂草检测体系的发展提供理论依据。

1 常用检测方法

1.1 培养皿法

培养皿检测法以其简单、快速、方便等特点[7]，一直被人们用于各类杂草抗药性检测试验当中。Perez等和 Lenardo等利用培养皿法成功检测了智利果园多花黑麦草(Loliummultiflorum)和巴西的马唐(Digitariainsularis)对草甘膦的抗药性水平[8-9]。培养皿检测法首先需要将待测杂草种子打破休眠，然后配制等量不同浓度的草甘膦药液，其浓度梯度设置为6～8个，一般设置为6个，其中1个为空白对照，待药液均匀浸湿滤纸后，再将刚露白的种子放在培养皿中。将培养皿放至恒温培养箱内，设置待测杂草最适的温度、湿度和光照条件。处理1～3周后，通过测定待测杂草种子的发芽数、主根长、芽长等指标，对其抗药性水平进行检测。不同种群的杂草，其参照指标并不相同。

1.2 整株检测法

整株检测法相对于培养皿检测法来说，其周期时间长，占用空间大，但因其具有简单易行、重复性好等优势，被认为是检测杂草抗药性最普遍有效的方法[10]，也被国际杂草抗药性管理组织推荐为主要检测方法[11]。杨彩宏等利用整株检测法成果地检测出广东省牛筋草(Eleusineindica)对草甘膦的抗性水平[4]。整株检测法一般采用Ryary法，将待测杂草的种子打破休眠后，统一进行盆栽，放置在温室或者培养箱中，设置待测杂草最适的温度、湿度和光照条件，杂草生长期间定时浇水，定期拔出非目标杂草。1～2个月后，待杂草长到5 cm以上，一般为3～6叶期为宜，不同杂草应根据本身条件而定。禾本科杂草一般为3～4叶期，阔叶杂草等须根据其生长情况而定，一般以其生物量适合称量为宜。处理前对待测杂草进行间苗，选择长势一致的为同一批次，用6～8个不同剂量的草甘膦溶液处理待测杂草，一般设置为6个，其中1个为空白对照，喷雾处理24 h内最好不要对施药杂草浇水。1～4周后，称取杂草地上部分，测量其鲜质量、干质量等指标。不同杂草应根据本身条件而定，不同剂量处理之后，待测杂草产生不同程度药害表现情况即可。并根据施药剂量和相应指标变化量得出线性回归方程，计算出引起50%死亡的剂量RD50。

1.3 症状指数法

草甘膦处理杂草后，杂草会对应出现叶片变黄、萎蔫等药害症状，一般其严重程度和施药剂量呈正相关。陈景超等根据杂草症状严重程度将其分为6个级别[12]。该方法前处理和整株检测法一样，待杂草喷药后，1～4周左右出现药害症状，可根据杂草的药害表现，对应相应级别，记录每个处理中每株杂草的级别，统计不同浓度处理杂草的总症状级别指数，得出线性回归方程。症状指数法操作简单，重复性好，可以同时和整株法联用；但是由于各个症状级别之间的界限不明显，植株症状表现形式划分也带有一定的主观性，所以具有一定的局限性，一般不将其作为主要的检测方法。

1.4 莽草酸含量法

草甘膦的作用机理主要是通过竞争性抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，造成莽草酸堆积，合成过程受阻[13]，使植株不能正常生长。抗性水平不一致的杂草被草甘膦处理过后，其植株体内莽草酸含量变化的情况也不一样，敏感种群植株会迅速积累大量莽草酸，明显多于抗性种群[14]。因此，通过检测比较杂草莽草酸含量变化，可以得出杂草是否产生抗药性。Vangessle 和Feng等 通过测定莽草酸含量，得出小飞蓬(Conyzacanadensis)对草甘膦的抗药性，其结果与整株法和培养皿法结果相同[15-16]。杨彩宏在检测牛筋草(Eleusineindica)对草甘膦的抗性水平的试验中，也使用了莽草酸含量法，其结果也得到验证[4]。莽草酸含量法操作简单，不用大量重复试验。用草甘膦药液处理长势一致的3～6叶期待测植株，以12 h为倍数设定样品采集间隔，采集待测植株顶端叶片组织，用液相色谱仪或者紫外分光光度计测量杂草体内莽草酸含量，依据杂草体内莽草酸随时间变化的趋势可以得出杂草抗性情况。设置不同浓度的草甘膦药液处理待测杂草，检测莽草酸含量，也可以得出待测植株对草甘膦的抗性水平[17]。

2 其他检测方法

2.1 EPSPS检测法

EPSPS是草甘膦作用靶标酶，通过测定草甘膦处理后植株靶标酶活力的变化，检测待测植株是否产生草甘膦抗药性。Baerson等通过对刚性黑麦草(Loliumrigidum)EPSPS活力测定，检测出不同刚性黑麦草对草甘膦产生不同抗性水平[18]。EPSPS检测法类似于莽草酸含量法，但是其操作复杂，需要灵敏度高的仪器，成本也较高。而且并不是所有的抗草甘膦杂草在草甘膦处理后，其EPSPS活性都会增加，因此，不能成为抗草甘膦杂草的常用检测方法，只适用于部分抗草甘膦杂草的检测。

2.2 叶绿素含量法和叶绿素荧光参数法

草甘膦由植株茎叶的吸收，通过紊乱植株体内蛋白质合成过程，导致植株死亡，其虽然不属于光合作用抑制剂类农药，但阮祚禧等[19]和卜贵军等[20]认为，草甘膦会对蓝藻葛仙米(N.sphaeroides)和大豆的光合作用和叶绿素荧光参数产生影响，因此，通过测定叶绿素含量变化和叶绿素荧光参数能够在一定程度上检测抗草甘膦杂草的抗药性水平。叶绿素含量法和叶绿素荧光参数法用不同浓度草甘膦处理长势一致的3～6叶期待测植株，处理1～2周后，随机采取植株顶端第2层完全展开的叶片为测量对象，以24 h为倍数设定样品采集间隔，规定采集时间段，采集样品。叶绿素含量测定可选用丙酮和乙醇的混合液浸提法[21]，或者HPLC等方法[22]，得出施药后不同抗性水平植株叶绿素a、叶绿素b的含量变化。管铭等[23]和杨彩宏等[4]都曾经利用叶绿素荧光参数法检测假稻种群[Leersiajaponica(Makino) Honda]和牛筋草(Eleusineindica)的敏感性和抗药性。

2.3 DNA分析法

目前，大部分杂草对草甘膦抗药性的机理研究都围绕杂草DNA、RNA分子方面展开。根据植物基因的改变情况和程度，也可为其抗药性水平推断提供依据。通过采集待测植株的样品，提取出总DNA，参考文献资料或者基因库设计合成引物，PCR扩增之后，获取EPSPS基因目的片段进行测序。通过同种杂草的同源性比对分析，可以检测杂草抗药性。2004年Ng等通过提取不同地区牛筋草(Eleusineindica)的DNA，测序比对EPSPS基因片段，得出抗性种群基因突变的结果[24]。2010年Gaines等通过提取长芒苋(Amaranthuspalmeri)的RNA，进行同源性分析，也得出抗性和敏感种群之间的差异[25]。此类方法具有取样简单、检测速度快、准确性高等优点，而且还可以同时为分析抗性产生的原因提供依据；但其重复性不高，每株杂草的突变点都不同，很难得出准确的抗性水平，所以较少用来作为杂草抗性的检测方法。

2.4 RT-PCR分析法

实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术1996年在美国推出之后，迅速在生物学各研究领域得到广泛运用，已经成为一项不可或缺的重要技术。与常规PCR相比，RT-PCR具有更强的特异性，并且能对模板进行定量分析。通过采集草甘膦处理后的待测植株，提取RNA，将其RNA反转录成cDNA之后，参考文献资料或者基因库设计合成引物，在PCR反应体系中加入荧光基团，PCR扩增之后，获取带有荧光基团的EPSPS基因目的片段，根据Ct值可以得出起始模板拷贝数[26]，反映出草甘膦处理后杂草EPSPS的表达量差异，因此根据待测杂草EPSPS表达量的差异，可以检测杂草抗药性。Gaines等通过提取长芒苋(Amaranthuspalmeri)的RNA，进行RT-PCR分析，得出抗性和敏感种群之间EPSPS表达量的差异[25]。

3 结论

随着草甘膦使用范围的扩大和使用量、使用年限的增加，抗草甘膦杂草种类数目快速增长[27-28]。除了本研究提及的检测方法，杂草抗药性检测还有其他方法，如分蘖检测法、花粉粒检测法等，由于这类方法实际操作中存在不足之处，所以没有用于杂草对草甘膦抗药性的检测。目前杂草对草甘膦抗药性检测中，运用最广泛的是整株检测法，该法简单易行，可以同时进行大量样本检测，而且结果准确性较高，但所需时间较长。而莽草酸含量法以及叶绿素含量法、叶绿素荧光参数法前期杂草处理跟整株检测法是相同的，因此，可以将这几种方法结合起来同时使用，提高检测结果的准确性，完善杂草对草甘膦抗药性的检测体系。杂草DNA、RT-PCR分析检测法取样简单，准确性高，虽尚处于起步阶段，但值得进行深入研究。

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