胶质瘤细胞中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的分析*

李朝晖 田 男 魏 君 李小玲 杜 超 李妍哲 田 宇

·基础研究·

胶质瘤细胞中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的分析*

李朝晖①田 男②魏 君①李小玲②杜 超①李妍哲①田 宇①

目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的差异。方法：RFPCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平。根据前期研究鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物，RT-PCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2 mRNA前体剪接模式的差异。结果：胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。RT-PCR检测到在胶质瘤细胞中，Exon 1a（+）/1a（-）、Exon 2（+）/2（-）的比值在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中无显著性差异。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明显高于正常星形胶质细胞HA1800。结论：Exon 5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中有显著性差异，Exon 5a（+）转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。

胶质瘤 RNA编辑 选择性剪接

1Department of Neurosurgery,Sino-Japanese Union Hospital of Jilin University,Changchun 130031;2Department of Cell Biolo

gy,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine School of Life Science,Hangzhou 310053,China

This work was supported by grants from the Jilin Provincial Science and Technology Development Plan for International S&T Co

operation Program(No.20130413028GH)

RNA编辑是一种重要的RNA转录后加工过程，其中最为常见的是A-to-I编辑，A-to-I RNA编辑具有重要的生理作用，该过程的异常与多种疾病有关［1-3］。其中谷氨酸受体GluR2 Q/R位点编辑效率的下降与胶质瘤的发生发展有关。A-to-I RNA编辑由RNA编辑酶ADAR2介导，ADAR2 mRNA的表达水平在不同的研究中结果不一致，存在ADAR2 mRNA表达水平不随GluR2 Q/R位点的编辑效率下降而同步下降的现象［4-7］。在前期研究中，检测到在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中，存在3个位点的选择性剪接。因此，推测ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式变化引起的ADAR2活性的改变可能与胶质瘤中A-to-I RNA编辑效率下降有关。本研究旨在比较胶质瘤细胞株和正常星形细胞中ADAR2选择性剪接模式的差异，探讨胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

人胶质瘤细胞株U87、U251、A172和人星形胶质细胞HA1800均购自中科院上海细胞所。

DMEM高糖培养基、含EDTA胰酶购于南京凯基生物科技发展有限公司。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青。Trizol试剂由美国Invitrogen公司提供。SuperRT cDNA第一链合成试剂盒、GoldStar Best Taq DNA Polymerase、Quick DNA Purification Kit快速DNA产物纯化试剂盒、Ultra SYBR荧光定量PCR试剂盒均购于北京康为世纪生物科技有限公司。PCR扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

美国Quawell超微量紫外分光光度计，德国Eppendorf PCR仪，美国Bio-Rad Chromo4多色实时荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HA1800、U87、U251和A172用含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL的DMEM培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.2.2 RT-PCR及基因测序检测GluR2 Q/R位点的编辑效率 处理后细胞溶于1mL Trizol溶液，提取细胞总RNA。SuperRT cDNA Kit试剂盒合成cDNA。GoldStar Best Taq DNA Polymerase扩增包含GluR2 Q/R位点的DNA片段。primer F：5'-ACCCTTGTGAGAGAAGAGGTGAT T-3'，primer R：5'-TGGAGCCAGAGTCTAATGTTCCA T-3'。反应体系为50 uL，包括5×GoldStar Best Taq PCR Buffer 10uL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，GoldStar Best Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 2 μL，primer F（10 μmol/L）1 μL，primer R（10 μmol/L）1 μL，添加去离子水使总体积达到50 μL。RT-PCR反应条件：95℃，10 min；94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、60 s，40个循环；72℃，10 min。Quick DNA Purification Kit快速DNA产物纯化试剂盒回收PCR产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定。测序工作由上海生工生物工程有限公司完成。计算GluR2 Q/R位点A、G的峰值，Q/R位点A-to-I编辑效率=G/（A+G）×100%。

1.2.3 实时荧光定量PCR 处理后细胞溶于1 mL Trizol溶液，提取细胞总RNA。SuperRT cDNA Kit试剂盒合成cDNA。根据剪接位点设计特异性引物分别扩增ADAR2的不同的选择性剪接转录本（表1）。反应体系包括1 μL cDNA，primer F 1 μL，primer R 1 μL，2×SYBR 12.5 μL，添加去离子水使总体积达到25 μL。β-actin作为内参。PCR环境设定在95℃10 min，依下列程序进行40个循环：95℃，15 s；56℃，30 s；72℃，30 s。每个样本设3个复孔，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点A-to-I编辑效率的检测

HA1800细胞中，GluR2 Q/R位点A-to-I编辑效率为100%，胶质瘤细胞株U87、U251及A172中，GluR2 Q/R位点A-to-I编辑效率分别为92%、89%、83%。胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点A-to-I编辑效率较正常胶质细胞均不同程度下降（图1）。

2.2 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2 mRNA表达水平的检测

Real-time PCR检测到胶质瘤细胞U87、U251、A172中总ADAR2 mRNA表达较正常星形细胞HA1800无明显改变（P＞0.01，图2）。

2.3 胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2选择性剪接模式差异的比较

Real-time PCR检测到在胶质瘤细胞中，Exon 1a（+）/1a（-）、Exon2（+）/2（-）的比值在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中无差异（P＞0.01，图3A，3B）。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明显高于正常星形胶质细胞HA1800（P＜0.01，图3C）。

3 讨论

A-to-I RNA编辑具有重要的生理作用，该过程的异常与多种疾病的发生发展有关。其中谷氨酸受体GluR2 Q/R位点编辑通过调节CDC14B/Skp2/p21/ p27通路抑制胶质瘤的生长，在胶质瘤中检测到GluR2 Q/R位点编辑效率明显下降［8］。证实GluR2 Q/R位点编辑效率在胶质瘤细胞U87、U251、A172中分别为92%、89%、83%，较正常星形胶质细胞100%明显下降。

A-to-I RNA编辑由RNA脱氨基酶ADAR2介导，ADAR2由3部分构成：双链RNA结合域（double-strand RNA binding domain，dsRBD），位于催化域的上游，对于特异识别和结合RNA底物起决定性作用；dsRBD上游的N端结构域；位于蛋白的C末端的催化脱氨基结构域，在催化反应中以锌作为亲核试剂与水相互作用。ADAR2基因全长为152 Kb，包含14个外显子，其中dsRBD由外显子2编码，催化脱氨基结构域由外显子4、5、6编码［9］。

人类ADAR2 mRNA前体存在复杂的选择性剪接，在ADAR2基因的5'-非编码区（5'-untranslated region，5'-UTR）、双链RNA结合域、催化脱氨基结构域和3'-UTR均存在选择性剪接位点。文献中已经发现的选择性剪接位点有8个，通过选择性剪接产生至少96种选择性剪接异构体（alternative splicing variants，ASVs）。ADAR2 mRNA前体在不同的组织、个体发育的不同阶段表现为不同的剪接模式［10-13］。

以往的研究显示，在胶质瘤中，ADAR2 mRNA的表达水平在不同的研究中结果不一致，且存在ADAR2 mRNA表达水平不随GluR2 Q/R位点的编辑效率下降而同步下降的现象。Mass等［4］检测到胶质瘤组织及细胞株中GluR2 Q/R位点编辑效率下降，但ADAR2 mRNA水平与正常脑白质比较无明显变化。Paz等［5］检测12例正常脑组织和18例胶质瘤组织的ADAR2 mRNA表达水平，发现与正常脑组织相比，胶质瘤组织中ADAR2 mRNA表达水平下降。Cenci等［6］检测10例儿童胶质瘤组织及肿瘤周围白质的ADAR2mRNA表达水平，发现胶质瘤组织中ADAR2 mRNA表达水平无明显变化。这种GluR2 Q/R位点的编辑效率下降和ADAR2 mRNA表达水平不同步下降的现象尚未能解释。

在之前的研究中，人正常星形胶质细胞HA1800和胶质瘤细胞U87、U251、A172中鉴定出ADAR2 mRNA前体存在3个选择性剪接位点。第1个剪接位点位于外显子-1和外显子1之间，产生Exon 1a；第2个剪接位点位于编码dsRBD的区域，引起整个Exon 2的缺失，产生提前终止密码子，导致mRNA的无义降解；第3个剪接位点位于编码催化脱氨基结构域的区域，引起Exon 5a（Alu重复序列，120个碱基）的插入，产生编辑活性下降的ADAR2［12-13］。这3个位点的选择性剪接均能对ADAR2的编辑活性产生影响。利用RT-PCR检测胶质瘤细胞和正常细胞中ADAR2 mRNA总的表达量，并分别比较由3个选择性剪接位点产生的选择性剪接转录本表达水平的差异。结果显示，胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中，ADAR2 mRNA总的表达量无明显差别。在第1和第2个剪接位点，胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞的剪接模式无明显差异。在第3个剪接位点，胶质瘤细胞表现为Exon5a（+）转录本优势表达，而在正常星形胶质细胞中，Exon5a（-）转录本优势表达。

基因的选择性剪接异常与多种肿瘤的发生发展密切相关，选择性剪接可通过影响肿瘤细胞的细胞周期调节、信号转导通路、凋亡、血管生成、侵袭和转移等参与肿瘤的发生发展过程［14-15］。结合研究结果，A-to-I RNA编辑的效率不仅与ADAR2总的表达量有关，也受选择性剪接的调节。在胶质瘤细胞中，ADAR2 mRNA的表达量无明显改变，但由于选择性剪接异常导致Exon5a（+）的转录本表达占主导地位，产生活性较低的ADAR2，引起胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点A-to-I RNA编辑水平下降。

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（2013-12-02收稿）

（2014-02-24修回）

（本文编辑：周晓颖）

Analysis of alternative splicing pattern of ADAR2 pre-mRNA in human glioma cell lines

Zhaohui LI1,Nan TIAN2,Jun WEI1,Xiaolin LI2,Chao DU1,Yanzhe LI,Yu TIAN1
Correspondence to:Yu TIAN;E-mail:tianyu2801@126.com

Objective:This study aims to analyze the differences in the alternative splicing pattern of ADAR2 among glioma cell lines U87,U251,A172,and normal human astrocyte HA1800.Methods:A-to-I editing level at the Q/R-Site of GluR-2 was analyzed by RT-PCR and sequencing.Real-time PCR was performed to detect the expression level of each alternatively splicing variant using a specific primer that was confirmed to amplify only the targeted template and not other alternatively spliced variant fragments.Results:We verified that the Q/R-Site of GluR-2 is under-edited in glioma cell lines.Real-time PCR revealed that the ADAR2 pre-mRNA splicing pattern has no significant difference at exons 1a and 2 between glioma cell lines and normal human astrocyte.We also detected that the amount of alternative splicing variants,including exon 5a,was higher than that of alternative splicing variants not including exon 5a in human glioma cell lines.However,the expression of alternative splicing variants,including exon 5a,was lower than that of alternative splicing variants not including exon 5a in human astrocyte.Conclusion:Evident differences in splicing were observed at the site of exon 5a between glioma cell lines and normal human astrocytes.The difference in the alternatively splicing pattern at exon 5a may be attributed to the decreased activity ofADAR2.

glioma,RNAediting,alternative splicing

10.3969/j.issn.1000-8179.20132046

李朝晖 博士，主治医师。研究方向为胶质瘤的发病机制和基因治疗。

①吉林大学白求恩医学部中日联谊医院神经外二科（长春市130031）；②浙江中医药大学生命科学学院

*本文课题受吉林省科技发展计划国际科技合作项目（编号：20130413028GH）资助

田宇 tianyu2801@126.com

E-mail：tianyu2801@126.com