miRNA海绵在胃癌细胞EMT过程中调控作用的体外研究*

李素丽 周 芳 张庆瑜 贾文亮 张安玲 韩 磊 康春生

miRNA海绵在胃癌细胞EMT过程中调控作用的体外研究*

李素丽①周 芳①张庆瑜①贾文亮①张安玲②韩 磊②康春生②

目的：探讨“miRNA海绵”在胃癌细胞系SGC7901上皮-间质转化（EMT）过程中的作用及机制。方法：将人工合成的ZEB2 3'UTR质粒及siZEB2采用脂质体Lipofectamine 2000转染SGC7901细胞。qRT-PCR检测转染后miR-200a/b/c的表达；Transwell侵袭实验、划痕实验和克隆形成实验检测细胞侵袭迁移增殖能力；Western Blot检测目的蛋白的表达。结果：与对照组相比，ZEB2 3'UTR转染组miR-200a/b/c的表达均下调，迁移、侵袭、增殖活性均增强；而转染siZEB2后miR-200a/b/c表达均升高，迁移、侵袭、增殖能力则下降。Western Blot显示ZEB2 3'UTR转染导致ZEB2表达升高，E-cadherin表达下降，而Vimentin表达上调；而转染siZEB2后，各项指标则表现出相反的表达趋势。结论：ZEB2 3'UTR可以通过调控miR-200a/b/c的表达调控胃癌细胞EMT过程，调节肿瘤的侵袭与转移。

miRNA海绵 胃癌 微RNAs上皮-间质转化 侵袭

1Department of Gastroenterology,2Laboratory of Neuro-Oncology,Tianjin Neurological Institute,General Hospital of Tianjin

Medical University,Tianjin 300052,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172356)and the Tianjin Municipal Key

Foundation of Basic Scientific Projects(No.10JCZDJC18500)

研究显示，“miRNA海绵”含有miRNA反应元件（MREs），能够特异性地抑制目标microRNA的功能［1-3］。miRNA是长约22nt的短链非编码RNA可与MREs互补结合而发挥负性调控基因的表达的作用。miR-200家族在很多上皮细胞癌中表达下调，锌指结合蛋白（ZEB）在多种恶性肿瘤中高表达，可导致E钙黏蛋白（E-cadherin）介导的细胞间黏附能力降低，细胞运动能力增加，上皮向间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）［4］。Brabletz等［5-6］提出miR-200家族可通过抑制ZEB的表达，使E-cadherin表达增加，抑制EMT。因此本研究应用人工合成ZEB2 3'UTR（miR-200家族结合的反应元件）及ZEB2的siRNA转染细胞，研究其对miR-200家族的调节作用网，观察并分析其对胃癌细胞系SGC7901生物学行为的影响，并对其可能的作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

ZEB2 3'UTR质粒由南京金斯瑞公司合成；转染试剂Lipofectamine购自美国Invitrogen公司；ZEB2，Ecadherin单克隆抗体购自美国Abcam公司；Vimentin购自博士得公司；MMP2/MMP9，PCNA单克隆抗体及相应二抗均购自北京中杉金桥公司；dNTP mixture、反转录酶（MMLV）、RNase抑制剂购自大连Takara公司；逆转录引物及qRT-PCR引物、荧光定量miRNA PCR试剂盒、siZEB2购自上海吉玛制药技术有限公司；matrigel购自美国BD公司；胃癌SGC-7901细胞由第四军医大学樊代明院士惠赠。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建与提取 GenBank数据库检索ZEB2基因核苷酸序列（Gene Bank，NM_001171653.1，NM_ 014795.3）找出其3'UTR含miR-200家族的结合序列全长，选用PGL3-Control表达载体（图1）。突变组采用碱基替换突变，将miR-200a/b/c结合的碱基序列行A和C，T和G替换，使质粒序列中无miR-200a/b/c结合序列。将序列交由南京金斯瑞公司合成。根据QIAGEN质粒中提试剂盒说明书进行质粒的提取与纯化。

1.2.2 细胞培养与分组处理 SGC-7901细胞应用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于含5%CO2，37℃的恒温培养箱中培养。实验分为5组：1）ZEB2 3'UTR组；2）突变组；3）无义序列组；4）siZEB2组；5）对照组。将处于对数期生长的细胞消化后接种于6孔细胞培养板中，细胞为（2～3）×105个/孔，根据Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，继续处理细胞48 h后进行下一步实验。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR检测细胞ZEB2 mRNA及miR-200a/b/c的表达变化 Trizol法提取待测细胞总RNA，按试剂盒说明书应用ZEB2、miR-200a/b/c特异性逆转录、PCR引物及相应组分配置反应体系。microRNA逆转录条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min。所得逆转录产物cDNA行qRT-PCR检测各组miR-200a/b/c的表达水平，反应条件：95℃10 min；95℃15 s，65℃30 s，72℃30 s；共40个循环；ZEB2 cDNA模板合成条件：42℃1 h。PCR扩增，以GAPDH为内参照，引物序列为ZEB2 F：5'-TGTAGATGGTCC AGAAGAAATGAA-3'；R：5'-TTGGCAAAGTATTCCT CAAAATCT-3'GAPDH；F：5'-ATGTTCGTCATGGGTG TGAACCA-3'；R：5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGGCA G-3'。扩增条件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40个循环；72℃5 min。数据按照2-ΔΔCt法进行计算分析。

1.2.4 Western Blot检测细胞蛋白表达水平 细胞裂解液RIPA裂解提取待测细胞的总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒压80V电转移至PVDF印迹膜。膜封闭液封闭1 h后，加入一抗ZEB2、GAPDH、Ecadherin、Vimentin、MMP2/9、PCNA（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000稀释），室温孵育1 h，用化学发光法显色，凝胶成像系统采集成像。GAPDH蛋白作为内参，目标蛋白相对表达量=目标蛋白条带灰度值/同一样本内参条带灰度值。

1.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 在具有8 μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清DMEM培养基稀释的Matrigel基质胶（Matrigel∶DMEM=1∶2），37℃培养箱孵育30 min后待其凝固，接种100 μL无血清培养基稀释SGC-7901细胞（1×106个/mL），下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，每组设3个复孔。37℃、5%CO2条件下培养24 h后，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，0.1%结晶紫染色5 min，用PBS洗涤。荧光倒置显微镜（×100）下采集图像，随机读取3个视野，取平均值为每组穿过小室细胞数。

1.2.6 细胞划痕试验检测细胞迁移能力 将已转染的细胞放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。次日用200 μL微量移液枪头在6孔板内垂直划痕，PBS液洗涤2次后加入无血清培养基，在倒置显微镜下观察0、48 h划痕两侧细胞的迁移情况，每组取3个部位拍照并测量划痕两侧细胞间的相对距离，距离差除以2为细胞相对迁移距离，计算细胞相对迁移率（相对迁移率=相对迁移距离/0 h时划痕边缘距划痕中线距离），重复3次并进行统计分析。

1.2.7 克隆形成实验检测细胞增殖活力 处理后细胞经胰酶消化后，细胞计数板计数后转移至6 cm细胞培养皿中，1 000个/皿，常规培养14 d后，倒置镜下观察克隆形成情况，弃去培养基，结晶紫甲醇溶液固定染色5 min后，PBS溶液洗去染料，倒置显微镜下观察克隆并计数，＞50个细胞的细胞团计为一个克隆，克隆形成率（%）=（克隆数/1 000）×100%。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料采用±s表示，3组及以上数据间比较采用单因素方差（χ2）分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组细胞内miR-200a/b/c及ZEB2 mRNA表达水平的影响

qRT-PCR结果显示：转染ZEB2 3'UTR后，SGC-7901细胞中miR-200a/b/c表达水平较空白对照组及突变组表达降低（图2A～C），以miR200b最为显著，ZEB2 mRNA表达上调（图3），差异具有统计学意义（P＜0.05）。转染ZEB2 siRNA后，ZEB2 mRNA及蛋白水平均下调（图3，4），miR-200a/b/c表达水平明显上升（图2A～C）。而突变组较对照组及无义序列组变化差异无统计学意义。

Western Blot结果显示：转染ZEB2 3'UTR后，细胞中ZEB2蛋白相对表达较对照组级突变组明显升高，E-cadherin相应降低，vimentin、MMP2、MMP9则增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。转染siZEB2，逆转EMT指标（图4，5）。

2.3 5组细胞内侵袭、迁移能力的变化

Transwell体外侵袭实验检测转染后穿过微孔的平均细胞数，结果显示：ZEB2 3'UTR组较对照组和突变组均升高，而ZEB2 siRNA组较对照和无义序列组均降低（P＜0.05，表1）；对照组和突变组差异无统计学意义（P＞0.05）。划痕实验结果显示：与对照组和突变组相比，ZEB2 3'UTR组细胞运动速度明显快于对照组，迁移率明显升高，而ZEB2 siRNA组胃癌细胞迁移能力有所下降（P＜0.05），对照组和突变组迁移率差异无统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.4 细胞增殖活性分析

转染ZEB2 3'UTR细胞克隆形成率较对照组显著升高，而ZEB2 siRNA组细胞克隆形成率较对照组显著降低（P＜0.05），对照组和突变组及无义序列组细胞数差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 5组转染后细胞侵袭能力、迁移率及克隆形成率比较 （n=3，±s）Table 1 Comparison of the invasive capability，migrating rates，and percentages of cell cloning after transfection among five groups（n=3，±s）

Cell numbers 213.67±3.51 140.33±3.06a142.67±3.78a62.67±4.61abc144.33±3.05ad642.967* Migrating rates（%）71.33±3.78 50.67±2.52a49.33±3.21a31.33±3.05abc51.33±4.04ad53.141* Percentages of cell cloning（%）60.66±0.81 41.13±0.55a41.43±0.50a23.90±0.89abc40.53±0.87ad923.683* Groups ZEB2 3'UTR group（1）Mutation group（2）Negative control group（3）siZEB2 group（4）Control group（5）F *P＜0.01；aCompare with the ZEB2 3'UTR group；bcompare with the mutation group；ccompare with the negative control group；dcompare with the siZEB2 group，all P＜0.01

3 讨论

“miRNA海绵”是一种人工合成的转录体，它将某种MRE的多个拷贝串联起来。通常将它克隆到病毒载体上，因此能在细胞中高表达，能够有效特异地抑制miRNA的功能［1，7］。ceRNA就是“内源性海绵”，含有多种microRNA的MREs，也能够影响多种microRNA的功能［8］。PTENP1的3'UTR及PTEN ceRNA ZEB2能与PTEN结合相同的miRNA，以miRNA依赖的方式调控细胞内PTEN和P-Akt蛋白水平；其缺失可致PI3K/AKT信号激活，诱导肿瘤发生［2-3］。含MREs的3'UTR具有强大的生物学活性，成为microRNA“诱饵”，螯合microRNA，从而影响它们对所表达的基因的调控。

本实验中转染ZEB2 3'UTR，作为“诱饵”：螯合miR-200家族，从而影响它们对靶基因ZEB2的抑制减弱，ZEB2 mRNA及蛋白水平均升高，且miR-200a/ b/c表达下调，以miR-200b降低最为明显，其中miR-200a/b/c表达变化可能与两种因素有关：一方面特异的miRNA结合位点结构与miRNA结合后触发miRNA加尾和3'到5'修剪及亚细胞定位而影响miRNA稳定性有关［9-11］；另一方面ZEB1/ZEB2能结合miR-200b/200a/429启动子区以调节其表达［12］；ZEB2 3'UTR的导入引起miR-200家族表达降低进而减弱其对ZEB1/ZEB2的抑制作用，升高的ZEB1/ZEB2则进一步加强了其对miR-200家族成员的表达抑制作用，形成一个正反馈调节作用。本实验进一步转染ZEB2 siRNA后miR-200a/b/c表达有所升高，从另一个方面验证了“miRNA海绵”对其靶基因的调控作用。

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EMT指上皮细胞失去极性，转化为成纤维细胞形态，与周围细胞的接触减少，细胞黏附力下降，迁移和运动能力增加［13-14］。此过程中，上皮细胞标志物E-cadherin等表达下调，间叶表型标记物波形蛋白（Vimentin）等表达上调。研究显示诱导ZEB2表达可增强Vimentin表达，抑制E-cadherin的表达并诱导细胞的体外侵袭能力，而抑制ZEB2表达可诱导E-cad-herin的重新表达［15-16］。本研究发现，ZEB2 3'UTR转染后细胞的侵袭迁移增殖能力增加，ZEB2表达升高，E-cadherin表达抑制，Vimentin、MMP2/9表达亦增加；而ZEB2基因沉默使得细胞的侵袭迁移增殖能力降低，Vimentin表达相应降低，E-cadherin重新表达，MMP2/9被抑制；研究表明ZEB2 3'UTR（“miRNA海绵”）通过调控miR-200家族表达形成一个正反馈作用影响ZEB1/ZEB2的表达水平来调控E-cadherin及Vimentin的表达影响EMT，其通过一系列复杂的分子调控机制调节肿瘤细胞的生物学过程，进而调节肿瘤的发生发展。

综上所述，ZEB2 3'UTR可以促进胃癌细胞的EMT过程并影响肿瘤细胞的侵袭与转移，此作用可能与ZEB2 3'UTR通过“螯合”miR-200家族进而影响miR-200靶向调控基因有关。证明了miRNA调控基因通过一种全新的机制彼此相互作用而形成调控网络，在肿瘤的生物学过程中发挥重要作用，有望成为RNA治疗模式的新方向。

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（2014-01-23收稿）

（2014-05-10修回）

（本文编辑：贾树明）

Regulating the EMT of human gastric cancer cell linein vitro through miRNAsponge

Suli LI1,Fang ZHOU1,Qingyu ZHANG1,Wenliang JIA1,Anling ZHANG2,Lei HAN2,Chunsheng KANG2
Correspondence to:Qingyu ZHANG;E-mail:zhangqy@tijmu.edu.cn

Objective:To explore the effect and mechanism of miRNA sponge on the epithelial-mesenchymal transition(EMT) of gastric carcinoma cell lines SGC7901.Methods:Synthetic ZEB2 3'UTR plasmid and siRNA targeting ZEB2 were transfected into the SGC7901 cell line by Lipofectamine 2000.Real-time quantitative polymerase chain reaction was performed to evaluate the expression levels of miR-200a/b/c.Finally,the migratory,invasive,and proliferative activities of the gastric carcinoma cellsin vitrowere analyzed by the scratch test,the Transwell cell invasion,and the cell cloning assay.The expression of the target protein was detected by Western blot.Results:Compared with the control group,the expressions of miR-200a/b/c significantly decreased,and their migration, invasion,and proliferation capabilities were considerably higher after they were transfected with ZEB2 3'UTR.Although the expressions of miR-200a/b/c significantly increased,the migratory,invasive,and proliferative activities of SGC7901 cells also degraded after they were transfected with siRNA targeting ZEB2.The expression of ZEB2 increased,and that of E-cadherin decreased at the protein level after they were transfected with ZEB2 3'UTR.The protein expression of Vimentin in SGC7901 cells significantly increased.The indicators show the opposite trend when cells were transfected with siZEB2,and the differences between the control and mutation groups were insignificant.Conclusion:ZEB2 3'UTR can regulate EMT course by regulating the miR-200a/b/c expression in gastric carcinoma,consequently regulating the invasion and migration of carcinoma cells.

miRNAsponge,gastric carcinoma,microRNAs,epithelial-mesenchymal transition,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.20140167

李素丽 硕士研究生。研究方向为胃癌的基础与临床研究。

①天津医科大学总医院消化内科（天津市300052）；②天津市神经病学研究所神经肿瘤实验室

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81172356）和天津市基础重点基础科技项目基金（编号：10JCZDJC18500）资助

张庆瑜 zhangqy@tijmu.edu.cn

E-mail：lisuli06@163.com