槟榔碱对2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用*

凌宏艳，姚起鑫，亓竹青，杨丝丝，何剑琴，张恺芳，胡 弼

（1.南华大学生理学教研室，2.南华大学基础医学博士后流动站，湖南衡阳421001）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是严重危害人类健康的常见病，目前其发病机理尚不十分明确。以肝糖输出过多为主要表现的肝脏胰岛素抵抗，是T2DM发生发展的关键环节之一。槟榔碱是从天然植物槟榔中提取的生物碱，研究发现槟榔碱体外给药能抑制口腔角质细胞内白介素和肿瘤坏死因子的表达，下调氧化低密度脂蛋白和高糖所致血管内皮细胞或巨噬细胞中炎症因子的表达，具有抗动脉粥样硬化的作用［1-3］。我们前期的研究发现槟榔碱能改善2型糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱，然而其机制仍不清楚［4］。

组成型雄甾烷受体（constitutive androstane receptor，CAR）与孕甾烷 X受体（pregnane X receptor，PXR）被称为“外源物感受器”，二者主要在肝中表达，在外源性物质及类固醇类化合物的代谢与清除过程中起着重要作用。随着研究深入，发现CAR、PXR在调节糖、脂代谢和炎症中发挥重要作用，或许成为肥胖和T2DM治疗的靶标［5-8］。因此，我们推测槟榔碱在整体动物模型上可能通过激活CAR或PXR，降低肝脏糖代谢相关酶和炎症因子表达，改善肝脏胰岛素抵抗。

1 材料与方法

1.1 材料

槟榔碱购自Sigma公司；D-果糖购自上海生工生物技术有限公司；猪油为市售；胰岛素检测试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司；即用型PCR扩增试剂盒购自Fermentas公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；蛋白检测试剂盒来自上海碧云天生物公司；抗AKT、P-Akt和GLUT4抗体购于细胞信号公司。

1.2 2型糖尿病（T2DM）大鼠模型的复制及实验分组

清洁级雄性Wistar大鼠45只，体重（200±20）g，由本校实验动物学部提供。大鼠分笼饲养（每笼4只），置于温度（22士 2）℃，光照 12／24 h，自由饮水，适应性喂养一周。取8只作正常对照组：普通饲料喂养，另37只采用高果糖高脂饲料［9］（按热卡计算：果糖占75%，脂肪占12%，蛋白质占13%）喂养。第12周末大鼠禁食12 h后，称重，尾静脉采血，HITACH自动生化分析仪检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），同位素法测定空腹血胰岛素水平（fasting insulin，FSI），当空腹血糖≥7.0 mmol／L为造模成功［10］。剔除建模失败的5只大鼠，将建模成功的32只大鼠继续以高果糖高脂饲料喂养，随机分为 T2DM组、T2DM＋不同浓度的槟榔碱（0.5，1，5 mg／kg）处理组（T2DM＋Are，8只／组）：以腹腔注射的方式按照分组每天给予不同剂量的槟榔碱处理，连续4周。正常对照组继续以普通饲料喂养。

1.3 样本处理

第16周末，各组大鼠禁食12 h后称重，并按体重给予戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，股动脉取血分离血清，用于血生化指标检测。另取部分肝组织迅速冷冻于-80℃冰箱，用于RT-PCR及Western blot检测。

1.4 血生化指标检测

空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），甘油三酯（triglyceride，TG），总胆固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL），低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL）由南华大学第一附属医院检验科HI-TACH717全自动生化分析仪测定。空腹血清胰岛素（fasting insulin，FSI）水平按照试剂盒要求检测。

1.5 RT-PCR检测

肝脏总RNA抽取采用TRizol一步法，按试剂盒要求操作，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：CAR（447 bp）：5’-TACCTGTTCAGCCATCACC-3’，5′-ACCGCATCTTCCATCTTGT-3′；PXR（357 bp）：5’-ATG TCT GAT GCC GCT GTG GA-3’，5′-GCT CTT GGA GGG AGG TTG GT-3′；G6Pase（157 bp）：5′-TCC TGG ACA CTG ACT ATT ACA-3′，5′-CCA CGA AAG ATA GCG AGA-3′；PEPCK（218 bp）：5′-CGC TGG ATG TCAGAAGAGG-3′，5′-GCAGTGAGTTCCCACCGTAT-3′；TNF-α（371 bp）：5’-ACA ACC AAC TGG TGG TAC CA-3’，5′-AAG TAC TTGGGCAGG TTG AC-3′；IL-6（512 bp）：5’-CCA CCA TGCCAT GGA GAA G-3’，5′-ATA TTT GGT CTG AGC ATG GTC AAG-3′；GAPDH（308 bp）：5′-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3′，5′-GGC TAA GCA GTT GGTGGT-3′；GAPDH（568 bp）：5′-AAGCCCATCACC ATCTTC CA-3′，5′-CCT GCC TCA CCA CCT TCT TG-3′。反应条件如下：94℃，5 min；94℃，40 s；59℃，30 s；72℃，30 s（32 cycles），72℃，10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以GAPDH为内参，定量分析各基因的相对表达量。

1.6 Western blot检测大鼠肝内AKT，p-AKT蛋白及GLUT4蛋白的表达

提取肝脏蛋白质，BCA微量蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，取蛋白样品30μg进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭、加入抗AKT、p-AKT蛋白或 GLUT4抗体孵育，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 槟榔碱对2型糖尿病大鼠体重、血糖、血脂和血胰岛素的影响

与正常组大鼠相比，T2DM组大鼠体重、FBG、FSI、TG、TC和LDL水平显著性上升，而高密度脂蛋白（HDL）水平显著性降低；1，5 mg／kg槟榔碱处理组能显著逆转上述改变（P＜0.05）。而 0.5 mg／kg槟榔碱处理组对上述指标无显著影响（表1），因此在后续的实验中剔除该组。

Tab.1 Effects of arecoline on body weight，fasting blood glucose，blood lipid and insulin levels in T2DM rats（¯x±s，n＝8）

2.2 槟榔碱对2型糖尿病大鼠肝脏PXR和CAR mRNA的影响

与正常对照组相比，T2DM组大鼠肝PXR、CAR表达降低。1，5 mg／kg槟榔碱处理后，PXR、CAR mRNA表达显著增加（图1）。

Fig.1 Effects of arecoline on mRNA level of PXR and CAR in T2DM rats（¯x±s，n＝8）

2.3 槟榔碱对 2型糖尿病大鼠肝脏 G6Pase，PEPCK和炎症因子表达的影响

与正常对照组相比，T2DM组大鼠肝脏G6Pase、PEPCK、TNF-α和 IL-6 mRNA表达增加，1，5 mg／kg槟榔碱能显著降低这些基因的表达（图2）。

2.4 槟榔碱对2型糖尿病大鼠肝脏AKT，p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表达的影响

与正常对照组相比，T2DM组大鼠肝p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表达降低。1，5 mg／kg槟榔碱可提高p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表达（图3）。

3 讨论

肝脏是机体能量代谢的主要器官，也是胰岛素作用的重要靶器官。肝脏胰岛素抵抗主要指胰岛素抑制肝糖输出能力减弱，是糖尿病等代谢综合征发病的主要环节，因此改善肝脏胰岛素抵抗可能是治疗T2DM的环节之一。

Fig.2 Effects of arecoline on mRNA level of G6Pase，PEPCK，TNF-αand IL-6 in T2DM rats（¯x±s，n＝8）

肝糖输出包括糖异生和糖原分解两部分，其中糖异生占重要地位［11］，这两个过程均可被胰岛素抑制。当胰岛素抵抗时，二个过程均增加；糖异生增加引起的内源性葡萄糖生成增多，是糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是调节糖代谢的两个关键酶，其中以G6Pase尤为重要，它催化了肝糖原分解和糖异生的最后一步反应，在肝脏两条产糖途径都起作用；PEPCK则催化糖异生的第1步反应［12］。越来越多的实验证明糖异生的过度活化与其关键酶PEPCK和G6Pase过表达有关，并且二者的表达主要在转录水平受到调控。本实验中高果糖高脂饲料诱导的2型糖尿病大鼠模型中PEPCK和G6Pase显著高表达，槟榔碱可抑制这两个基因的表达，提示：槟榔碱可通过抑制PEPCK和G6Pase的表达、减少糖异生，改善肝胰岛素抵抗。

Fig.3 Effects of arecoline on protein level of phosphorylated-AKT and GLUT4 in T2DM rats（¯x±s，n＝8）

槟榔碱作为一种外源性化合物进入体内，需要肝脏“外源性化合物感受器”PXR、CAR负责对其代谢、解毒。近年来研究发现CAR、PXR与控制糖脂代谢及炎症表达的转录因子间存在交叉对话，对机体营养物质代谢尤其是肝脏的物质代谢和炎症具有重要意义［5-8］。如：CAR或 PXR能直接与 FoxO1结合，阻止后者结合到糖异生基因PEPCK和G6Pase，起到降糖作用；PXR、CAR还能通过NF-κB途径抑制TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的表达［13］，而炎症因子具有明显诱导胰岛素抵抗作用［14］。为此，在本实验的预实验中，根据相关文献分别设置了低剂量（0.5，1，5 mg／kg）、中剂量（10 mg／kg，20 mg／kg）、高剂量（50 mg／kg）槟榔碱处理T2DM大鼠。结果发现中高剂量（10 mg／kg，20 mg／kg，50 mg／kg）槟榔碱腹腔注射，大鼠数天后出现流涎、犬坐、竖毛、战栗等毒性反应，且出现时间与严重程度随剂量增大而加重；而1 mg／kg和5 mg／kg槟榔碱处理T2DM大鼠，无毒副作用，且能显著降低血糖，因此，在随后的机制探讨中，我们只选用1 mg／kg和5 mg／kg槟榔碱处理大鼠，观察槟榔碱对大鼠肝 PXR，CAR，炎症因子 TNF-α、IL-6表达的影响。结果显示：1，5 mg／kg槟榔碱能显著提高T2DM大鼠肝脏PXR和CAR表达，降低TNF-α、IL-6的表达，而槟榔碱对正常大鼠上述各项指标无显著影响（结果未显示）。

研究显示：胰岛素诱导的GLUT4转位异常是IR的重要特征，其中Akt在促进GLUT4的转位中起着重要作用［15］。因此本实验检测了槟榔碱对大鼠肝脏胰岛素信号通路中p-AKT和GLUT4表达的影响。结果显示：1，5 mg／kg槟榔碱能显著提高T2DM大鼠肝脏p-AKT和GLUT4蛋白表达水平。提示：槟榔碱可能通过促进大鼠肝脏GLUT4的转位改善T2DM大鼠肝脏IR。

综上所述：槟榔碱一方面可能通过 PXR、CAR影响糖代谢相关基因的表达；另一方面可能通过PXR、CAR抑制T2DM大鼠肝脏炎性因子的表达，最终促进大鼠GLUT4的转位来改善T2DM大鼠肝脏IR；然而槟榔碱对脂质影响的具体机制有待进一步实验。

［1］ 张 伟，周寿红，凌宏艳，等.槟榔碱抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的小鼠巨噬细胞炎症因子表达及其机制［J］.中国动脉硬化杂志，2009，17（4）：269-172.

［2］ 石翠格，胡 刚，汪 海.天然药物槟榔碱对氧化低密度脂蛋白致血管内皮细胞损伤的保护作用研究［J］.科学技术与工程，2007，7（12）：24-28.

［3］ 段智变，汪 海.高糖致内皮细胞粘附分子基因的过度表达以及槟榔碱的调节作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2006，11（1）：27-32.

［4］ 姚起鑫，亓竹青，王 光，等.槟榔碱改善2型糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱［J］.中国药理学通报，2009，25（11）：1477-1481.

［5］ Gao J，He J，Zhai YG，et al.The constitutive androstane receptor is an anti-obesity nuclear receptor that improves insulin sensitivity［J］.J Biol Chem，2009，284（38）：25984-25992.

［6］ Jiang M，Xie W.Role of the constitutive androstane receptor in obesity and type 2 diabetes：a case study of the endobiotic function of a xenobiotic receptor［J］.Drug Metab Rev，2013，45（1）：156-163.

［7］ Spruiell K，Richardson RM，Cullen JM，et al.Role of pregnane X receptor in obesity and glucose homeostasis in male mice［J］.J Biol Chem，2014，289（6）：3244-3261.

［8］ Kittayaruksakul S，Zhao W，Xu M，et al.Identification of three novel natural product compounds that activate PXR and CAR and inhibit inflammation［J］.Pharm Res，2013，30（9）：2199-2208.

［9］ Reaven GM，Hwang IS，H oH.Fructose-induced insulin resistance and hyperten sion in rats［J］.Hypertension，1987，10（5）：512-516.

［10］郭啸华，刘志红，李 恒，等.高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点［J］.中国糖尿病杂志，2002，10（5）：290-294

［11］赵惠中，萧建中，杨文英，等.肝脏胰岛素抵抗与肝糖输出调控基因表达的关系［J］.中华肝脏病杂志，2006，14（1）：45-48.

［12］Goto M，Yoshioka T，Battelino T，et al.TNFalpha decreases gluconeogenesis in hepatocytes isolated from 10-day-old rats［J］.Pediatr Res，2001，49（4）：552-557.

［13］ Zhou C，Tabb MM，Nelson EL，et al.Mutual rep ression between steroid and xenobiotic recep tor and NF-kappaB signaling pathways links xenobiotic metabolism and inflammaion［J］.J Clin Invest，2006，116（8）：2280-2289.

［14］张利华，张 薇，韦广洪，等.α-亚麻酸对糖尿病大鼠炎症介质和氧化应激的影响［J］.中国应用生理学杂志，2012，28（1）：64-67.

［15］Van DE，Govers R，James DE.Akt activation is required at a late stage of insulin-induced GLUT4 translocation to the plasma membrane［J］.Mol Endocrinol，2005，19（4）：1067-1077.