Ihh-PTHrP信号轴对软骨内成骨作用机制的研究进展

综述, 审校

(南华大学附属第一医院脊柱外科,湖南衡阳421001)

脊椎动物骨骼的形成有软骨内成骨和骨膜内成骨两种方式,其中软骨内成骨是在相关转录因子的调控下,由间充质细胞首先分化为软骨细胞,软骨细胞分泌1型胶原和蛋白聚糖构成软骨基质,部分软骨细胞进一步肥大,演变成肥大细胞,并分泌X型胶原和血管内皮生长因子,随后新生血管形成,伴随肥大细胞不断降解,成骨祖细胞随新生血管进人矿化前沿,并分化为成骨细胞,启动成骨过程[1],在该过程中,一系列内分泌激素及生长因子相互作用,诸如甲状旁腺激素相关肽(PTH-related peptide,PTHrP)、印度豪猪蛋白(Indian hedgehog,Ihh)、Sox9,FGF,BMP 等,通过复杂的反馈机制调控软骨内成骨的过程,现已证实PTHrP-Ihh信号轴、Notch、Wnt信号系统等多种信号通路在软骨内成骨过程中发挥重要作用[2],而PTHrP-Ihh信号轴对软骨内成骨的作用机制已成为近年来的研究热门之一,但迄今为止尚无明确的结论。

1 PTHrP对软骨细胞的增殖分化调控作用

1.1 PTHrP及PTHrP受体

甲状旁腺激素相关肽基因定位于人第12条染色体,其结构和功能相对复杂,与PTH具有很大的同源性,广泛分布于人体胰腺、肾、牙齿、皮肤、骨骼等多个组织器官中,且发挥着关键性的生理作用,比如参与细胞增殖、分化、生长过程、参与平滑肌的松弛、参与人体内钙磷代谢,以调节骨矿化等[3]。PTHrP包括9个外显子和3个启动子,人体代谢过程中,采用不同的RNA剪切方式,也会产生不同的蛋白质结构形式,具有抑制破骨细胞活性、促进成骨细胞增殖和促进成骨的作用,因此又称为骨抑制素。在胚胎软骨内成骨中,PTHrP主要由关节处的软骨内细胞分泌,且作用于下层细胞,抑制肥大细胞凋亡和软骨细胞的进一步分化。PTHrP与PTHrP受体-1结合,该受体主要分布在骨骼和肾脏组织中,属G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)超家族中B亚族成员,其具有7个穿膜区,胞外氨基端较长,含有3对以上的二硫键,折叠成网状,胞外区协同穿膜区的螺旋结构,共同参与配体的结合[4]。因此,两者具有相同的亲和力,发挥作用的主要是位于细胞外的氨基酸,这也是配体结构域,一旦受体被激活,通过PKA、CAMP信号途径的腺苷酸环化酶就会发挥作用,从而进一步发挥调节细胞分化和生长的作用[5]。

1.2 PTHrP对软骨细胞增殖和分化的调控

软骨细胞增殖和分化中,PTHrP有着重要的调控作用[6]。在软骨内成骨中,PTHrP的主要作用就是限制软骨细胞的成熟与分化,且对软骨内成骨细胞的生长调节过程造成相应的干扰,最终对人骨骼的形成形态和骨骼生长造成影响。如高耀祖等[7]发现Indian hedgehog在软骨内成骨和骨关节炎作用的研究进展中,一旦软骨骨骺端形成,位于骨骺端的软骨膜细胞及其周围软骨细胞就会不断分泌PTHrP,同时作用于细胞上的PTHrP受体,当肥大软骨细胞分化时,且软骨细胞不再增殖时,PTHrP就会阻止其作用,导致软骨细胞分化停止,促进软骨细胞的继续增殖。这充分证明PTHrP参与了软骨细胞的分化、生长过程,抑制了软骨细胞的肥大化,促进了软骨细胞的形成。

2 Ihh对软骨细胞增殖和分化的调控

印度豪猪蛋白属于豪猪蛋白基因家族中的一种亚型。相关研究发现在脊椎动物中存在三种Hedgehog蛋白亚型,即音速豪猪蛋白(sonic hedgehog,Shh)、印度豪猪蛋白(indian hedgehog,Ihh)和沙漠豪猪蛋白(desert hedgehog,Dhh),Dhh主要在睾丸精母细胞上表达,是睾丸发育所必须的调控因子;Shh主要在胚胎极化活性区中表达,参与多种器官形态发生的调节;而Ihh则主要在前肥大和肥大软骨期细胞上表达,在软骨内成骨过程中发挥着关键性作用,是软骨增殖、分化及生长形成过程中的另一个重要因素[8]。印度豪猪蛋白受体为膜受体Patehed-l=(Ptcl)[9],其与 Ptcl结合后,活化膜蛋白Smoothened(Smo),Smo与Gli2和Gli3发生作用,触发Glil转录过程[10]。Ihh不仅自身控制着软骨细胞的生长与分化,而且还在一定程度上通过作用于PTHrP,抑制着软骨细胞的肥大和成熟,与此同时,还有着诱导充质细胞的表达,使得这些细胞向着成骨细胞分化,以形成骨领[11]。刘来奎[12]发现Ihh信号在胚胎发育期软骨内成骨中的调控机制显示Ihh的表达标志着细胞从增生到分化的转化,且主要发生于肥大前软骨细胞,在软骨内成骨形成过程中,Ihh的作用与PTHrP保持着良好的一致性,阻止着软骨细胞肥大的发生。

Ihh在表达过程中产生缺陷,极易发生短肢侏儒并伴随着生长板肥大软骨细胞现象的不断扩大和软骨细胞增殖率的下降[13],因此,采取激活Ihh信号的方法,能够使PTHrP的表达水平上调,如丁然等[14]关于脉冲磁场与前软骨干细胞向成熟软骨细胞的增殖与分化研究结果显示:激活Ihh信号可以有效地阻止正常基因个体增生带软骨细胞的分化,其研究结果充分证实了Ihh通过PTHrP产生了调节作用。Ihh是介导机械应力信号向生物学信号转导的重要媒介之一,Ihh及PTHrP在软骨内的表达可以被机械应力所触发,体外研究证实,在机械应力作用下,Ihh表达量显著增加,机械应力作用可通过Ihh表达量的改变而影响软骨细胞的生物学行为[14],Tang等[15]在临床实验中发现,下颌骨前伸可以促进间充质细胞分化,在此过程中髁突软骨增殖带和成软骨细胞层内Ihh表达增强,其表达水平的增高和增殖带内增殖细胞的数量和增殖的速率成正相关,髁突软骨增殖带和成软骨细胞带交界处PTHrP表达增强,间充质进入增殖带的细胞数量显著增加。Wu等[16]通过对体外三维软骨细胞培养体系的研究,发现在周期性机械应力刺激下,2天后软骨细胞中的Ihh mRNA的表达可增加18倍,软骨细胞明显增殖,且这种促软骨细胞增殖作用可以被Ihh的功能抑制抗体完全消除。

3 Ihh-PTHrP对软骨细胞增殖和分化的调控机制

增生带软骨细胞在向肥大软骨细胞分化之前将先表达PTH/PTHrP受体-1,Ihh和PTHrP主要在软骨细胞、初级骨小梁之间以及次级骨化中心表达,研究发现,Ihh和PTHrP的表达存在着同步性,两者共同作用促进软骨的分化、增殖,在软骨的成形过程中发挥着关键性的作用,维持着长骨的生长,且Ihh还在一定程度上促进PTHrP的合成分泌,且在细胞正式分化的过程中,会促进Ihh蛋白的表达,而表达的Ihh蛋白会作用于肥大软骨细胞,并进一步作用于关节软骨膜以及细胞带的软骨膜,诱导这些部位PTHrP的表达[17]。王欣等[18]发现,当次级骨化中心一旦形成,Ihh分泌也会相应地达到高峰,在PTHrP反馈调节作用下,Ihh表达数量也会有所减少,且抑制骨和软骨内的过度发育,确保软骨内成骨处于动态平衡状态下。李明辉等[19]发现PTHrP信号会促进生长板PTH/PTHrP及受体的表达,并使得肥大软骨细胞扩大的进一步转化,且促进其转化为软骨细胞,确保了生长板软骨细胞合成软骨基质的主要特征和功能作用,其研究结果充分证实了PTHrP-Ihh通过该负反馈环路协调软骨细胞的增殖、成熟和分化以平衡正常生长板生长和矿化过程。又有相关研究[20]显示在骨骺生长板PTHrp-Ihh信号轴及相关因子调节机制的研究中发现,当Ihh分泌达到高峰时,在PTHrP反馈调节作用下,抑制骨和软骨内的过度发育,确保软骨内成骨处于动态平衡状态,更深刻的揭示PTHrP的生物学功能和骨骺细胞分化发育规律,人为调控骨骺干细胞的分化奠定了坚实基础。

4 Sox9,FGF,BMP等生长因子在PTHrP-Ihh负反馈轴中的作用

4.1 Sox9在Ihh-PTHrP负反馈轴中的作用

Sox9基因是Sox家族中的一员,属于编码转录因子的高迁移组盒子超家族,在软骨内成骨的过程中发挥着不可替代的作用,其表达于间充质干细胞凝聚、软骨细胞分化之前,在除肥大细胞外的几乎所有软骨前体细胞及软骨细胞上表达。人类的Sox9基因位于染色体17q上,cDNA全长约为2.2 kb,编码509个氨基酸,Sox9蛋白的N端含有一个能与DNA结合的HMG-box(SRY-related high-mobility group box),在其C端含有一段富含脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的转录激活区域。Huang等[21]发现,Pthrp的信号靶点为在软骨内成骨的生长板中促进软骨形成的转录因子Sox9。Amano等[22]发现,鼠原代软骨细胞和间充质干细胞中单独Sox9或Sox5、Sox6、Sox9同时过表达可抑制其细胞成熟及钙积作用,并上调PTHrP表达,Sox5、Sox6、Sox9通过结合于PTHrP基因启动子活性,刺激软骨细胞早期阶段的增殖和发育,在器官形成阶段抑制软骨细胞的成熟和钙积作用;另外,通过与Ihh/Gli2信号协同作用,对PTHrP表达和软骨细胞分化进行调控。

4.2 FGF在Ihh-PTHrP负反馈轴中的作用

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF)是一组具有相似结构特征且广泛存在于机体组织内的多肽,其家属包括20多个成员及至少4个相应受体,对软骨细胞的增殖和分化起重要作用。FGF-1、FGF-2 同其受体 FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3都在软骨中存在表达,受体FGFR-1主要表达于肥大软骨细胞上,受体FGFR-2表达于增殖区软骨细胞,而受体FGFR-3同时表达于骨骺周围的La Croix环和增殖区软骨细胞上[23]。Wakisaka等[24]研究证实,激活FGFR-3可通过下调Ihh及PTHrp的mRNA表达来抑制软骨细胞增殖。然而骨移植物体外实验研究发现,在 PTHrP-/-and PTHrP-/-/FGFR3-/-鼠,在发育性骺软骨中缺乏PTHrP可导致明显低增殖表型;在PTHrP-/-鼠发现如下的异常:非肥大细胞出现于肥大细胞间并在肥大区出现过度凋亡;而在PTHrP-/-/FGFR3-/-鼠中未出现以上现象。FGF信号系统独立于Ihh/PTHrP的作用,加速肥大软骨细胞最终分化[25]。由此可以推断,FGF信号系统调节软骨内成骨的机制可能是通过降低软骨细胞的增殖和抑制Ihh的表达这两条途径,从而缩短增殖柱高度,抑制软骨内成骨的速度。

4.3 BMP在Ihh-PTHrP负反馈轴中的作用

BMP即骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP),拥有至少15个以上的成员,为三大类TGF-β超家族分子之一,广泛分布在软骨组织中,并且依靠多条途径诱导间充质干细胞向软骨细胞分化,在软骨细胞增殖、分化的晚期发挥重要的作用[26]。亚型不同的BMP在骨髓生长板中的分布与作用都不相同,BMP-5主要表达于增殖区软骨细胞上,BMP-6主要表达于前肥大和肥大软骨细胞上,而BMP-2、BMP-7在整个生长板中均匀一致地表达[27]。国外研究者[28]分别将BMP及Noggin(BMP抑制剂)加入至骨移植物中,其结果为前者增加了软骨细胞的增殖,而后者阻断了软骨细胞的增殖;前者延迟了肥大性软骨细胞终末分化,而后者加速了终末期肥大软骨细胞的分化。BMP-2通过对Ihh的增量调节促进软骨形成,在软骨的形成过程中起上调作用。BMP通过对前肥大软骨细胞Ihh表达的增加,从而实现软骨细胞增殖的增加及软骨细胞柱的延长[29]。在BMP-6参与下的骨骺生长板中PTHrplhh信号轴的负反馈调控中,PTHrP通过对BMP-6表达的抑制,间接实现抑制软骨细胞成熟的作用,提示在前肥大软骨细胞中的自分泌-旁分泌中,BMP-6对软骨分化具有重要作用。

总而言之,在软骨内成骨过程中,PTHrP和Ihh均发挥着调节作用,抑制着软骨细胞的分化,且通过PTHrP的反馈调节作用,抑制软骨细胞向着肥大细胞分化转化,并且在机械应力的作用下,参与关节软骨的构建,虽然两者在成骨过程中存在着一定的共性,也存在着一定的差异性,为此,需要加强对PTHrP和Ihh对软骨内成骨过程的作用机制的研究,为揭示特发性脊柱侧凸的分子生物学机制、提高诊断治疗水平提供支撑。

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