新型PD模型研究进展

东惟玲 方琪 单立冬

帕金森病(Parkinson disease，PD)多见于老年人，平均发病年龄为55岁，70岁及以上人群发病率达120/10万。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直和步态障碍为主要特征。其病理学特点包括黑质纹状体多巴胺(dopamine，DA)能神经元缺失和胞质内路易小体(Lewy bodies，LB)的形成。自从1817年由英国医生Parkinson首次提出至今已被广泛研究了近两个世纪，但PD的病因学和发病机制仍然不是很清楚。既往研究表明，PD是遗传和环境因素相互作用的结果[1]，是多种因素导致的疾病。

PD动物模型一般可分为两种：一种是利用生活中存在的或者半合成的神经毒素造模，另一种是利用PD相关基因产生突变造模。神经毒素模型又包括可逆性和不可逆性两种，最近几年的研究焦点均放在了药物引起的不可逆性的PD模型病理和症状表现的研究上。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopa，6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)是使用最广泛的神经毒素，鱼藤酮是最新发现的用于PD造模的稳定的神经毒素。所有神经毒素造模的共同特点是产生氧化应激，进而引起DA能神经元细胞的死亡。PD相关基因(如α-synuclein、parkin、LRKK2、PINK1、DJ-1等)的发现加深了对PD的了解。尽管绝大部分的PD是散发性的，但是家族性和散发性PD的主要发病机制、对左旋多巴反应的一致性以及相似的发病形式，都表明二者具有相同的引起神经退行性变的最终通路。因此基因模型在揭示PD中DA能神经元死亡的分子机制和发现潜在的治疗靶点方面有着非常重要的意义。

1 鱼藤酮PD模型

鱼藤酮是从热带植物中提取的化合物，它是鱼藤酮类化合物中作用最强的神经毒素，半衰期依曝光时间而定，大约3～5 d。鱼藤酮同MPTP一样具有很高的脂溶性，很容易通过血-脑脊液屏障和生物膜，而且不需要DA转运体的转运。它可以选择性地破坏DA能神经元[2]，减少酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性细胞数，导致PD症状的出现[3]。自2000年鱼藤酮被首次提出以来，引起广泛关注，其被注意的原因主要有两个：一是流行病学研究结果显示有机农药和农村偶发PD发病率高有密切关系；二是鱼藤酮复制了PD患者大多数的运动症状和组织病理特点，尤其是LB的形成。

1.1作用机制关于鱼藤酮造模机制有很多不同的看法。作为氧化呼吸链抑制剂，鱼藤酮被认为是抑制线粒体氧化呼吸链复合体I的氧化磷酸化，使ATP减少导致细胞能量不足而死亡。然而Sanders等[4]研究认为鱼藤酮导致DA能神经元退行性丢失的最初机制是氧化损伤而非ATP的减少：鱼藤酮与复合体I结合，减少电子向泛醌的流动，因而产生更多的自由电子与氧分子结合为氧负离子，进而导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，损坏复合体I本身和呼吸链的其他成分；ROS还可以损害线粒体的其他蛋白和大分子物质。 Cicchetti等[5]认为鱼藤酮抑制线粒体复合体I的电子从铁硫中心向泛醌转运，生成的大量ROS超出了DA能神经元自身的抗氧化清除能力，引起细胞的损伤。鱼藤酮还可以引起细胞内半胱天冬酶的活化，进而引起细胞凋亡[6]。很多学者更倾向于鱼藤酮引起的细胞损伤是多种途径的，多方面因素共同导致细胞死亡。

1.2造模方法到目前为止，鱼藤酮建立模型的方法主要有全身性的系统给药和脑内定位注射。

1.2.1全身性系统给药：又包括口服、静脉给药、皮下注射和腹腔注射。口服引起极少的神经毒性；使用渗透泵慢性全身注射是最常见的处理方法；腹腔注射可引起行为障碍和神经生化方面的缺损，但死亡率很高；静脉注射可以引起黑质纹状体DA能神经元的损伤，同时伴随着α-突触核蛋白聚集、LB形成、氧化应激和胃肠道问题。

1.2.2脑内定位注射：常见的脑内注射部位有纹状体、黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)、内侧前脑束(median forebrain bundle,MFB)和丘脑的腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)。因注射部位不同可引起不同的反应。研究表明，向大鼠脑部的纹状体(12 μg/只)、SNpc(6 μg /只)和MFB(12 μg/只)分别注射鱼藤酮，结果引起纹状体的DA含量明显减少，与对照组相比依次减少30%，62%，96%[7]。在Sindhu等[8]的实验中，向SNpc和MFB注射鱼藤酮(12 μg/只)，第32天经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析发现都可以引起DA明显减少，SNpc注射减少超过80%，而MFB超过95%。由此可见MFB对鱼藤酮更为敏感。行为学和神经生物化学结果显示，鱼藤酮引起的MFB损伤动物模型最接近6-OHDA引的起黑质损害[9]。但要达到纹状体DA减少80%只需要鱼藤酮2.5 μg/只，而6-OHDA则需要6～8 μg/只[10]，表明鱼藤酮更有潜力。

脑内注射部位不同引起的行为学表现也不完全相同。向SNpc注射鱼藤酮，大鼠在麻醉苏醒后立即出现向注射部位对侧旋转，这一行为将持续1 d多，然后慢慢消失，至第3天完全消失[8]，而向纹状体和MFB注射不会出现这种自发的旋转行为。药物诱导的旋转实验周期和旋转的方向也不相同：向大鼠纹状体和SNpc注射鱼藤酮，14～16 d后即可用阿扑吗啡诱导旋转检测模型是否成功，而向MFB注射需到28～30 d才会出现明显的旋转行为，这对快速鉴定是否造模成功不利，但是MFB体积大、对鱼藤酮敏感等优点使其应用较多。另外，阿扑吗啡引起的旋转方向不完全相同：MFB注射组大鼠向对侧旋转而纹状体组和SNpc组大鼠向同侧旋转。向VTA注射鱼藤酮引起中脑边缘的DA缺失，与PD模型的非运动症状有关。

1.3局限性鱼藤酮建立的PD模型可以引起注射同侧脑内的TH+神经元缺失，可以复制大多数的PD患者的运动症状和病理组织特点改变，尤其是 LB的形成[11]，但这种模型会引起大脑的非特异性的损伤和外周器官的毒性。Xiong等[12]认为PD大鼠模型主要出现肝小叶中央静脉断裂、肾小球和间质红细胞增多、肺泡壁变薄易破和中性分泌物出现、脾脏大出血等，而对心脏和胃影响较小。相反，Ravenstijn等[13]研究认为皮下注射鱼藤酮引起的全身毒性以心脏和胃最为突出。 Binienda等[14]在2013年首次报道了慢性鱼藤酮处理与外周神经病理损害有关。在Norazit等[15]的实验中，注入黑质纹状体系统的所有浓度的鱼藤酮均会引起纹状体周围组织的损伤和坏死，即使0.5 μg的低剂量也会引起自身生理和炎性反应损害。Klein等[16]的实验结果显示，对照组和实验组均会出现超出黑质边缘区域的宏观损伤。

同其他的神经毒素一样，鱼藤酮造模除引起上述的非特性损伤外，还存在实验方面缺陷：首先，它不能准确地概括涉及中枢神经系统多个区域的渐进性的病变过程；另外该造模的急性特点，把正常情况下需要几十年的退行性病变过程加速到动物生命的几天或几年内完成。

2 基因模型

尽管神经毒素模型对PD的研究提供了很大帮助，但是它们不能很准确地阐明渐进性的发病过程和PD的本质以及在人类中的病理分布。在过去的十几年中，一些与家族性PD相关基因的发现，预示着新的PD模型到来，各种各样的PD相关的哺乳类、非哺乳类的动物模型被创造出来。第一个被公认的PD相关基因是α-synuclein基因，随后又发现许多其他的常染色体显性或隐性形式遗传的基因，这些基因包括parkin、DJ-1和LRRK2等。最近的研究显示，编码葡糖脑苷脂的基因突变也与家族性PD相关[17]。

2.1造模机制基因模型的造模机制主要是根据PD相关基因编码蛋白的功能来造模，这些蛋白表达的过多或过少可能都会导致PD的发生。α-synuclein基因是最早发现的与家族性PD相关的基因。目前，广泛认为α-synuclein基因的突变，例如碱基的替换(A53T、A30P等)、碱基重复等都与家族性PD的发病相关。α-synuclein是LB的主要成分，这些理论基础有力地支持了通过使野生型和突变型过表达这种蛋白来造模的说法。α-synuclein作为PD相关基因被发现不久，即有报道Parkin基因的突变可以通过常染色体隐性遗传的方式引起青少年PD。一般认为，Parkin是一种与蛋白酶体降解途径相关的泛素连接酶，这种蛋白的缺失会导致某些底物神经毒素的累积。LRRK2是一种组成很多独立结构域的大分子量蛋白，其中一个就是表现出GTP依赖性磷酸化激酶的结构域。LRRK2基因突变被认为是最常见的引起PD的基因突变，其中最常见的是G2019S突变，在家族性PD中约占5%～6%，散发性PD中占1%～3%[18]。

2.2造模方法目前应用较多的造模方法是利用病毒载体介导的转基因和基因敲除，例如通过短发卡结构RNA介导基因敲除，干扰内源性基因的表达。这一理论已经通过腺病毒载体(recombinant adeno-associated viral，rAAV)介导的TH基因敲除得到证实，自身短发卡结构RNA介导的TH基因沉默会导致DA的缺失，进而出现动物的行为异常。在Anvret等[19]的研究中，醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases，ADH)基因敲除小鼠模型与同窝出生的正常小鼠相比会引起DA系统相关的行为学改变。Mulcahy等[1]向大鼠单侧黑质纹状体系统注入腺病毒相关的α-synuclein(AAV-α-synuclein)发现，大鼠纹状体过表达α-synuclein，并且这个过表达的基因产物可以向轴突末端传递，并在胞内聚集引起黑质纹状体神经元胞体和突起的丢失，引起对侧明显的运动功能损害。为了更加全面地复制PD模型，他将环境因素(鱼藤酮)和遗传因素(AAV-α-synuchein)结合起来，依次注射AAV-α-synuclein和鱼藤酮，先使α-synuclein过表达，再利用神经毒素引起病变。结果显示单独注射鱼藤酮或AAV-α-synuclein都会引起大鼠运动功能障碍和潜在的黑质纹状体系统神经元的退化，当二者共同作用时，运动症状和黑质纹状体的缺失比单一因素作用时明显很多。

基因模型并不只是模拟家族性PD的发病过程，Mandel等[20]就建立了一种新型的散发性PD基因模型，方法是利用短发卡结构RNA的慢病毒载体(recombinant lentiviral，rLV)侵染黑质源性细胞系使泛素连接酶复合体中的必需成分——SKP1A基因敲除，结果SKP1A缺乏会导致细胞死亡的敏感性上升和DA能神经元表型标记物表达的下降。当诱导分化时，SKP1A基因沉默的基因不会停留在G0/G1期，而是进入异常的细胞周期并导致渐进的细胞死亡。

2.3局限性转基因技术造模耗时较长，过程相对复杂，而且在模型逐渐成长的过程中可能会产生某些基因代偿性的表达以及PD相关基因广泛表达产生的混杂的副作用。病毒载体模型过程简单而迅速；在成年鼠中进行可以避免相应基因的代偿表达；可以将相关基因的表达限制在感兴趣的区域，如黑质，并且可以单侧处理两侧比较观察，避免转基因技术的缺点。需注意的是，转基因和基因敲除模型不能引起黑质多巴胺神经元渐进性的缺失，而这正是PD主要的病理变化，故只能模拟疾病早期阶段。

综上所述，神经毒素模型逐渐建立起与人类PD病理特征一致的动物模型，基因学研究揭示了PD的遗传学机制和发病特点；神经毒素模型在筛选症状治疗的药物方面作用很大，而基因模型在评价基因在PD中的作用很大；神经毒素模型缺点是模拟PD的晚期，对研究疾病的治疗产生一定的困难，而基因模型是使用过表达或基因敲除技术模拟疾病早期阶段，没有特征性的DA能神经元的缺失。因此，在PD疾病模型方面还有很多工作要做，力求寻找一个能够涵盖PD各种特征、具有相似发病过程、快速有效且安全的单一的PD模型。

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