酪氨酸酶活性与黑素生成关系的基础及临床研究

闻人庆 陆伟宏 严春霞 张鸿鸣 综述，何国产 审校

（金华职业技术学院医学院生物化学教研室浙江金华321007）

酪氨酸酶活性与黑素生成关系的基础及临床研究

Basic and clinical research of the relationship between the activity of tyrosinase and the synthesis of melanin

闻人庆 陆伟宏 严春霞 张鸿鸣 综述，何国产 审校

（金华职业技术学院医学院生物化学教研室浙江金华321007）

黑素细胞是产生黑素的高度特异性细胞，细胞内的高尔基体可合成黑素小体，为黑素合成的场所。树突是黑素细胞形态学的重要特征性标志，在黑素转运中起着至关重要的作用。它形成树枝状分叉，朝邻近的角质形成细胞生长，促使黑素细胞将黑素输送给它们，增加机体色素沉着[1]。黑素是一种化学本质为蛋白衍生物的无定形小颗粒，广泛存在于人的皮肤、毛发和眼球组织中，决定着相应部位的颜色。并吸收阳光中的紫外线，保护皮肤不受阳光照射的伤害,因此,又称作光防护色素。可分为真黑素（eumelanin）和褐黑素（pheomelanin）两类，前者在黑色毛发中大量存在，后者在褐色及红色毛发中比率相对较高。黑素生成异常与黄褐斑、白化病等色素障碍性疾病关系密切，伴随着人们对自身形象越来越高的追求，对黑素的相关研究日益成为医学美容界关注的热点问题。本文就酪氨酸酶的活性与黑素生成关系的基础及研究综述如下。

1 酪氨酸酶基因家族、酪氨酸酶及黑素的生成

1.1 酪氨酸酶基因家族与酪氨酸酶：酪氨酸酶基因家族成员包括酪氨酸酶基因（TYR基因）、酪氨酸酶相关蛋白1基因（TYRP1基因）和酪氨酸酶相关蛋白2基因（TYRP2基因）等。它们的序列具有高度一致性，共同作用于黑素细胞，调节黑素生成的种类和数量。

核心成员TYR基因在人类定位于11q14-q21,长度超过65kb,包括5个外显子和4个内含子，是眼皮肤白化病Ⅰ型（OCA1）的致病基因。其第一外显子最长,几乎占了全部编码序列的一半。基因上游存在着TATA、CAAT盒等调控序列。在11p11至着丝粒区域,存在着一个TYR基因的相关序列，是第四和第五外显子的同源序列,同源性高达97%[2]。其编码的酪氨酸酶是由529个氨基酸残基组成的黑素小体跨膜酶蛋白,分子量为55KD,糖基化后分子量为65～75KD。包括CuA和CuB这两个铜原子结合位点、由18个氨基酸残基组成的信号肽及C末端疏水的跨膜区[3]。

TYRP1基因在人类定位于9p23，是眼皮肤白化病Ⅲ型（OCA3）的致病基因。该病患者的黑素并不会完全缺失，但在数量和类型上发生了改变。其编码的酪氨酸酶相关蛋白-1（TYRP1）是由537个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作用与酪氨酸酶相似但活性较弱[4]。酪氨酸酶相关蛋白-2 (TYRP2)与TYRP1在一级结构上非常相似,折叠后亦形成相似的三级结构。

1.2 黑素的生成：黑素的生成是一个复杂的生化过程,酪氨酸酶在其中发挥酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶和5，6二羟基吲哚氧化酶的作用。首先，酪氨酸在酪氨酸酶的催化下生成多巴（DOPA），该反应即为黑素合成过程中限速步骤。依旧在酪氨酸酶的催化下，多巴氧化为多巴醌（DQ），后者经过多聚化反应生成无色多巴色素。无色多巴色素极不稳定，可被另一分子多巴醌迅速氧化成多巴色素。而后多巴色素在TYRP2的作用下可以羟化为5，6二羟基吲哚羧酸（DHICA），也可以脱羧为5，6二羟基吲哚（DHI）。5，6二羟基吲哚经由酪氨酸酶催化氧化为5，6-吲哚醌，为真黑素形成的前体。由5，6二羟基吲哚转化来的真黑素为黑色的，由5，6二羟基吲哚羧酸转化而来的真黑素为棕色，TYRP1活性增强有利于黑色真黑素的生成。真黑素与褐黑素的生成比率则主要与酪氨酸酶活性水平相关,酶活性增高促使真黑素生成增加[3]。

1.3 酪氨酸酶对于黑素合成的影响：酪氨酸酶靠跨膜肽段固定于黑素小体膜上,影响其在黑素小体膜上的定位及黑素小体腔内pH改变等，均可致黑素合成障碍。酪氨酸酶氨基末端的信号序列对于其正确定位至关重要，突变可能导致的信号肽消失引起酪氨酸酶的错误折叠并迅速降解。同时，铜原子和酶蛋白的结合对于酶发挥催化功能也具有非常重要的作用，一个铜原子与酶的结合有助于酶与另一个铜原子的结合。据对眼皮肤白化病的致病突变研究显示，致病的无义突变和移码突变相对随机地分布于酪氨酸酶基因的编码区,而错义突变的分布则明显呈现出5个簇集区。除CuA、CuB结合区外,其他3个分别位于CuA与氨基末端之间、CuA与CuB之间、CuB与TM区域之间[5]。据此推测致病的错义突变或者影响了酶与Cu原子的结合，或干扰酶与底物的结合,从而影响酪氨酸酶活性。有些突变还可能引起酶蛋白生成过程的分选异常,致使蛋白多肽提前降解,黑素小体内的酪氨酸酶活性大幅度降低甚至消失[3]。在非黑素细胞，通过增加胞内细胞器的pH值，酪氨酸酶从内质网到达高尔基体进行糖化加工，然后由运转囊泡携带至Ⅱ期黑素体[6]。将正常的和突变的TYR基因在COS-7细胞中表达,发现突变后的基因产物并不能象野生型那样通过内质网移行入黑素小体,而是滞留在内质网。而内质网内的监控机制对蛋白质的微小异常高度敏感,酪氨酸酶微小的改变都可能导致降解,使酶活性大幅度的降低甚至消失，致黑素的生成障碍[7]。研究表明,至少部分TYR基因的错义突变通过引起酪氨酸酶的成熟异常使黑素的合成发生障碍,进而引起眼皮肤白化病。还有研究显示突变的酪氨酸酶在内质网中与分子伴侣结合延迟,不能正常折叠因而无法输出[8]。

TYRP1对黑素合成初期的酪氨酸酶发挥羟化酶和多巴氧化酶活性有明显的促进作用，是决定不同人种黑素生成及分布的重要因素。TYRP2则具有加速黑素生成作用。同时，酪氨酸酶活性在TYRP1和TYRP2存在时更加稳定，表明两者对维持酪氨酸酶在黑素小体膜上的稳定具有重要作用。

2 黑素与疾病及美肤

各种因素都可能通过改变酪氨酸酶活性影响黑素的合成。探究这些影响因素与皮肤等处色素沉着之间的关系，对于阐明某些色素障碍性疾病的发病机制，预防其发生或开展有效的临床治疗具有非常重要的指导意义。

2.1 黑素生成过多：在我国群众生活水平提高的同时，越来越多的人尤其是女性开始密切关注自身皮肤的美白状况，而皮肤的色素沉着等亚健康状态却始终是困扰着人们的一个难题。黄褐斑是多发生于颧颊部的一种色素沉着性疾病，亚洲人发病率很高，为基底层黑素颗粒增多所致。黑素细胞痣即日常所说的痣、雀斑、老年斑、甚至黑色素细胞瘤等也都是人体黑素生成过多的临床表现。过量使用激素或长期接触重金属离子可刺激皮肤角质形成细胞产生一系列炎症细胞因子，诸如前列腺素、干细胞因子、一氧化氮等都可加重皮肤色素沉着[9-11]。此外，劳累、紧张焦虑及睡眠不足时，垂体分泌大量促黑细胞激素，增加黑素合成。女性经期、妊娠期及某些卵巢性疾病致雌激素分泌增多，酪氨酸酶催化作用增强，也可导致黑素形成增加[12]。

色素沉着的过程十分复杂，黑素的合成与转运是最为重要的两个环节。单位体表面积的黑素细胞呈对称分布，颈部最多，上肢、后背次之，下肢、胸部最少，这一分布特点恰与身体各部位接受紫外线数量的梯度一致。表明紫外线照射，尤其是中波紫外线(UVB)可以促进释放多种刺激因子，诱导黑素细胞分裂增殖，增加黑素生成，并增强黑素小体的转运。但当UVB照射剂量到达某个临界点后，黑素细胞又随着照射剂量的增加而迅速降低。同时光照可致酪氨酸酶基因表达增加，促成黑素的生成。另一方面，酪氨酸酶的活性亦随着UVB照射剂量的增加而增强,直达到某一最大照射剂量。此最大照射剂量基本与之前所述的黑素细胞达最大数量时的UVB照射剂量平行。此后,酶活性将保持高水平但不再增长。另据研究表明，对体外黑素细胞进行热处理可增加黑素细胞及酪氨酸酶活性，促进黑素合成。证实了日光中的红外线及激光治疗等产生的热效应对皮肤亦有类似紫外线的作用[13]。

2.2 黑素生成不足或缺如：酪氨酸酶基因突变所致的OCA1是最常见和表型严重的眼皮肤白化病类型。患者毛发呈白色或浅黄色,皮肤呈白色且对紫外线格外敏感易被灼伤,患皮肤癌的可能性较正常人增高。眼黑素缺乏导致严重视力低下,伴屈光不正、畏光和眼球震颤等表现。可分OCA1A和OCA1B两个亚型，是同一基因不同突变导致酶蛋白功能异常程度不同的结果。前者酪氨酸酶完全没有活性或根本没有酶产生，患者皮肤和毛发终生呈白色，眼部症状也非常严重。后者的基因还能编码生成有残存活性的酪氨酸酶,患者毛发颜色呈浅黄色或黄棕色。皮肤暴露于日光中亦可刺激黑素生成,视力症状也可因眼部色素的增加而略有改善[14]。

致病机制复杂的白癜风临床研究颇为广泛，多认为是具有遗传素质的个体在各种内外因素的作用下，免疫、精神及神经内分泌等方面的功能紊乱所致。患者酪氨酸酶系统被抑制或黑素细胞遭到破坏，黑素生成障碍引发皮肤色素脱失。

3 酪氨酸酶抑制剂与激活剂的应用研究

作为黑素合成过程中的限速酶，激活或抑制酪氨酸酶的活性即可有效调节体内黑素的生成数量，达到相应的医学及美容用途。

针对酪氨酸酶活性抑制的研究，在防紫外线辐射及美白化妆品的研发等领域具有广阔的应用前景。过去几十年间，大量具有酪氨酸酶抑制活性的化合物相继被发现，但只有极少部分的化合物或提取物被成功地应用于国民产业。其中的大部分由于来源受限、安全性差或抑制活性弱等原因，并无实际的应用价值。目前市场上美白化妆品所采用的增白添加剂，诸如维生素类化合物、苯甲醛类化合物以及植物提取物，无论是天然提取还是化学合成的，均为通过抑制该酶的活性而发挥作用。传统的抑制剂因其所固有毒副作用，目前已逐渐被植物提取物所取代，虽然植物提取物有不稳定、易失活、不易组合配方及纯度不高等缺点。有文献归纳一些多酚类物质，特别是具有2，4-二羟基取代单元的黄酮类和二苯乙烯类化合物具备成为较好的酪氨酸酶抑制剂的条件[15]。部分桑科和豆科类植物体内这类物质含量丰富，如何从这些植物中提取低毒、高效的美白活性成分已成为国内外相关领域的研究热点和重要方向。

同理，酪氨酸酶激活剂能促进黑素的合成。相关研究不仅能为阐明黑素缺失性疾病的发病机制提供理论支持，也可为寻找相关疾病的治疗药物奠定基础。国外曾见十二烷基磺酸钠、苯甲醇和丝氨酸蛋白酶对酪氨酸酶有激活作用的报道。国内的研究已证实从中药补骨脂中提取得到补骨脂素对酪氨酸酶有一定的激活作用[16]。中医治疗白癜风的有效方剂滋补肝肾方含药血清对黑素细胞酪氨酸酶活性有正向的调节作用,并可促进TYRP1 mRNA,TYR mRNA及蛋白的表达,这可能是滋补肝肾方临床治疗白癜风的机理之一[17]。王建华等[18]发现丹参、何首乌等10种中药对酪氨酸酶有着不同程度的激活作用，也已将这一研究结果应用于白癜风患者的临床治疗。杨慧兰等[19]用桃仁、红花、赤芍、丹参、丹皮等成分合成的复方中药“白癜冲剂”，能提高酪氨酸酶mRNA的表达，增加黑素合成，临床治疗白癜风疗效明显。最新报道，有学者[20]从中医治疗白癜风的方剂中筛选其中的45味进行相关的酪氨酸酶活性影响实验，显示有21种对酪氨酸酶有一定的激活作用，其中以女贞子的作用最明显。

酪氨酸酶抑制剂和激活剂作为皮肤美白产品及黑素缺失性疾病的临床用药，将是相关领域的重点研究对象，天然来源的中药具有广阔的应用前景。后续的研究有必要进一步对其中有效成分进行分离纯化，验证其中有效化学成分，着重将增效减毒作为重点研发方向，明确其应用价值。

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编辑/李阳利

2014-10-09

2014-11-28