抗TNF-α抗体减轻创伤感染应激高血糖大鼠急性胰岛素抵抗的实验研究*

曲 卫 张 静 姜兆顺* 万国峰 韩晨东 李 霖 王 静 李美晔 张胜兰

抗TNF-α抗体减轻创伤感染应激高血糖大鼠急性胰岛素抵抗的实验研究*

曲 卫①张 静△姜兆顺①*万国峰①韩晨东①李 霖①王 静①李美晔①张胜兰①

目的：研究抗肿瘤坏死因子α抗体(anti-TNF-α antibody)对腹部创伤合并感染脓毒血症大鼠的急性胰岛素抵抗的影响机制。方法：建立大鼠创伤脓毒症导致高血糖的动物模型，并随机分为4组，分别给予大剂量和小剂量抗TNF-α治疗；通过血糖、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量试验以及高胰岛素正葡萄糖钳夹试验等方法比较各组大鼠的差异。结果：采用抗TNF-α抗体治疗可显著降低术后血清胰岛素水平、葡萄糖耐量、葡萄糖输注率和肝组织Akt磷酸化水平，提高mTOR磷酸化水平。结论：抗TNF-α抗体治疗可调节肝组织胰岛素信号通路Akt和mTOR的磷酸化水平，进而减轻创伤感染应激后大鼠急性胰岛素抵抗程度。

应激性高血糖；大鼠；抗TNF-α抗体；胰岛素抵抗

[First-author’s address] Department of Endocrinology, Jinan General Military Hospital, Jinan 250031, China.

创伤后血糖升高的现象非常普遍，其持续存在将导致全身炎症反应、诱发感染以及影响组织修复，增加多器官功能不全的发生率和病死率。炎性因子是引起慢性胰岛素抵抗的重要原因。前期研究发现，抗肿瘤坏死因子α(anti-tumor necrosis factor-α，anti-TNF-α)单克隆抗体治疗可以降低大鼠创伤感染应激条件下的炎性因子水平及肝组织内炎症通路的信号分子表达，提高大鼠的生存率，提示炎性因子水平的改善可能有助于减轻急性胰岛素抵抗的发生。本研究拟通过观察anti-TNF-α抗体干预对腹部创伤合并感染的大鼠的急性胰岛素抵抗的影响，并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立和动物分组

SPF级8周龄Wistar大鼠200只，体质量为230～250 g，购自山东大学医学院实验动物中心。采用实验大鼠盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)术＋内毒素(3 mg/kg)腹腔内注射方法，建立创伤脓毒症致高血糖模型。将大鼠随机分为4组：大剂量抗TNF-α抗体治疗组(TNF组)、小剂量抗TNF-α抗体治疗组(tnf组)、非药物干预手术对照组(Cntl组)和正常对照组(CN组)。其中单克隆TNF组6 mg/kg腹腔注射，tnf组3 mg/kg腹腔注射。大鼠使用氯胺酮麻醉，开腹后将盲肠末端以手术线结扎，再以手术针头刺破肠壁，挤出少许粪便，然后将盲肠纳入腹腔，逐层缝合腹壁。术毕腹腔内以3 mg/kg注射内毒素，大鼠自由进食进水，观察7 d。

1.2 血糖与血清胰岛素测定

大鼠CLP术后12 h内使用强生稳豪血糖仪测定其鼠尾末梢毛细血管血糖，每2 h监测血糖1次，每日监测血糖3～4次，ELISA法监测大鼠血清胰岛素水平。

1.3 葡萄糖耐量试验

大鼠CLP术后第24 h进行腹腔注射葡萄糖耐量试验。每只大鼠按10 ml/kg体重进行腹腔注射10%葡萄糖注射液，记录注射前及注射后0.5 h、1 h、2 h、3 h鼠尾末梢血糖值，为防止血糖仪误差，每个时点均连续测2次血糖，取均值。

1.4 正葡萄糖钳夹试验

葡萄糖耐量试验结束后，以氯胺酮麻醉大鼠，直视下进行颈内静脉和股静脉穿刺插管，分别连接静脉输液装置及注射泵，一台注射泵固定速率输注常规人胰岛素(200 mμ/kg bolus，20 mμ/kg/min)，另一台连续输注20%葡萄糖，监测血糖(5 min/次)，根据血糖水平调节葡萄糖输注速度，当血糖水平达到稳定(约为5.0 mmol/L)并持续50 min后记录葡萄糖的输注速率。

1.5 蛋白质印迹

采用蛋白质印迹(Western blot)法检测大鼠肝脏组织P-sr473位点磷酸化Akt与总Akt、磷酸化mTOR与总mTOR的表达水平，并根据灰度值计算P-sr473Akt/Akt、P-mTOR/mTOR的表达比率。蛋白质印迹所需抗体：抗-phospho-S473-Akt、抗-total-Akt、抗-phospho-mTOR、抗-totalmTOR，购自美国Santa Cruz公司。取大鼠肝组织0.2 g，与提取缓冲液混匀制备匀浆，置于-80 ℃冰箱储存备用。采用蛋白测定BCA法测定组织裂解液中蛋白质浓度。取各组30 ug蛋白质上样溶解于10%SDSPAGE电泳分离，然后转移至醋酸纤维膜，封闭过夜，加入一抗孵育2 h，洗膜，依次加入二抗及底物孵育1 h，TTBS溶液洗2次，TBS溶液洗1次。将化学发光试剂ECL的A液和B液等量混合，点于转印膜上，室温孵育1 min，倾掉ECL混合液，使用保鲜膜覆盖后置暗盒中暴光。X光片扫描成像，经凝胶自动分析成像系统和ImageJ图像分析软件对图中印迹区带进行定量分析。以cntl组作为对照组，比较各组大鼠上述实验结果的差异。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行相关统计分析，计量资料以均数±标准差表示，以α=0.05作为检验标准，采用单因素方差分析进行两两组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间的平均血糖水平和血清胰岛素水平比较

大鼠血糖水平于术后1 h开始急剧升高，4～6 h达到峰值，6 h以后缓慢下降，至术后1周时仍然高于术前水平，各组大鼠创伤后各时间的平均血糖水平无显著差异(如图1所示)。

图1 各组大鼠术后不同时间血糖水平比较

TNF组和tnf组于术后6～72 h的血清胰岛素水明显减低，cntl组相比其差异有统计学意义(F=5.543，F=3.677；P＜0.05)，且呈剂量依赖性(如图2所示)。

图2 各组大鼠术后血清胰岛素水平动态比较

2.2 各组大鼠葡萄糖耐量试验结果

各组与NC组相比，大鼠葡萄糖耐量均显著升高，存在统计学差异(F=7.895，F=10.944，F=11.770；P＜0.01)；与cntl组比较，TNF组对术后第24 h大鼠经腹腔注射的葡萄糖耐量具有降低作用，其差异有统计学意义(F=4.086，P＜0.05)；而同时间tnf组仅有轻微降低作用，无统计学差异(如图3所示)。

图3 各组大鼠葡萄糖耐量实验结果

2.3 各组大鼠高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果

高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果显示，与NC组相比，各手术组葡萄糖输注率均显著减低，其差异有统计学意义(F=14.338，F=6.229，F=8.631；P＜0.05）；同时，TNF组和tnf组抗TNF-α抗体治疗组的葡萄糖输注率高于cntl组，两两比较具有统计学差异(F=6.062，F=5.892；P＜0.05)。

图4 正葡萄糖高胰岛素钳夹实验结果

2.4 大鼠肝组织Psr473Akt/Akt和P-mTOR/mTOR的蛋白表达比率

与cntl组相比，各抗TNF-α抗体治疗组均可不同程度地降低大鼠肝组织Akt的磷酸化水平，降低效果呈剂量依赖性，TNF组比tnf组降低效果更强(F=9.931，P＜0.05) (如图5所示)。

图5 各组大鼠P-Akt/Akt蛋白表达比较

与cntl组相比，各抗TNF-α抗体治疗组均可提高大鼠肝组织mTOR的磷酸化水平，效果呈剂量依赖性，即TNF组优于tnf组(F=10.954，F=6.125；P＜0.05)(如图6所示)。

图6 各组大鼠P-mTOR/TOR蛋白表达比较

3 讨论

应激性高血糖在创伤、失血、脓毒症、烧伤和危重症患者中非常常见[1-3]。创伤和急危重症引起的高血糖，往往会增加并发症发病率和病死率，给疾病预后带来不良结果[4-5]。创伤与危重症引起的应激性高血糖发生，是由于肌肉组织对外周葡萄糖摄取减少和肝脏葡萄糖输出增多所导致，通常被认为是急性胰岛素抵抗的表现，包括胰岛素受体前和(或)后信号转导通路受阻因素。

近年来，针对肥胖和2型糖尿病的慢性胰岛素抵抗的机制研究发现，TNF-α与慢性胰岛素抵抗的发生关系密切。多项基础研究表明，抗肿瘤坏死因子α抗体可以改善脂肪细胞分泌的炎症因子引起的慢性胰岛素抵抗[6-7]。采用抗TNF-α单克隆抗体在治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的临床试验研究，意外获得了帮助改善这类患者的胰岛素抵抗状态的益处[8-10]。尽管已知TNF-α对急性胰岛素抵抗有一定的影响，但抗TNF-α抗体治疗对于急性胰岛素抵抗的作用机制，目前还所知甚少[11]。本研究结果发现，抗TNF-α抗体治疗虽然对创伤应激状态下大鼠葡萄糖水平无明显帮助，却可以降低创伤后血清胰岛素水平，并呈剂量依赖性的改善大鼠创伤后24 h的葡萄糖耐量和提高高胰岛素正葡萄糖钳夹试验的葡萄糖输注率。因此，抗TNF-α抗体治疗可能会通过改善创伤与危重症患者的急性胰岛素抵抗而使拮抗TNF-α治疗成为一种治疗急性胰岛素抵抗的手段。

本研究前期结果提示，胰岛素强化治疗可以降低高血糖危重症患者的炎性因子水平，从而改善患者生存率。然而，近年来的系列临床研究却认为强化胰岛素治疗对这部分患者并不能获益，强化胰岛素治疗因增加低血糖事件的发生而增加了患者的病死率，从而导致了阴性结果[12-13]。因此，针对创伤后的重症患者能够改善其急性胰岛素抵抗分子机制的一些治疗思路，可能会对预防和治疗应激性高血糖提供新的治疗方法。近期临床试验发现，抗TNF-α抗体治疗能够改善类风湿关节炎患者的胰岛素抵抗状态[14]。而在有关脓毒症的临床试验中，抗TNF-α治疗却未能显示其显著改善病情的疗效，其主要是因为试验结果受患者病情严重程度的影响更为显著[15]。然而动物实验研究显示，TNF-α抗体治疗能够降低脓毒症实验动物的血清TNF-α和IL-6水平，减少机体的蛋白质分解代谢，减轻血清皮质醇水平升高的幅度，提高腹腔感染伴多器官功能障碍实验动物的生存率和改善胰岛素受体底物和胰岛素c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号的激活，能够降低高脂餐饲养大鼠的血糖脂代谢紊乱和肝脂肪变程度[16]。使用TNF-α抗体治疗也能够提高丙型病毒性肝炎患者的胰岛素抵抗状态。

本研究结果发现，抗TNF-α抗体干预可以呈剂量依赖性地降低大鼠肝组织Psr473Akt/Akt的表达比率，提高大鼠肝组织P-mTOR/mTOR的表达比率，提示拮抗TNF-α治疗对于肝组织胰岛素受体后信号转导具有一定调节作用，其可能是作用于肝组织胰岛素信号通路Akt和mTOR的磷酸化水平，从而减轻创伤应激后急性胰岛素抵抗程度。

[1]Lasram MM，Dhouib IB，Annabi A，et al.A review on the molecular mechanisms involved in insulin resistance induced by organophosphorus pesticides[J].Toxicology，2014，322C：1-13.

[2]许琦，杨文东.急性心肌梗死合并应激性高血糖患者心功能与并发症的临床观察[J].临床医学，2013，33(8)：16-18.

[3]Strilka RJ，Armen SB，Indeck MC.Qualitative analysis of subcutaneous Lispro and regular insulin injections for stress hyperglycemia：A pilot numerical study[J].J Theor Biol，2014，356：192-200.

[4]任晓红，刘虹.血糖控制对危重症应激性高血糖患者炎症介质表达的影响[J].中国药物与临床，2014，12(1)：78-81.

[5]Sudhakara G，Mallaiah P，Sreenivasulu N，et al.Beneficial effects of hydro-alcoholic extract of Caralluma fimbriata against high-fat dietinduced insulin resistance and oxidative stress in Wistar male rats[J].J Physiol Biochem， 2014，70(2)：311-320.

[6]王佳丽，朱慧娟，曾勇.脂肪因子与冠状动脉粥样硬化关系的研究进展[J].中国心血管杂志，2013，18(3)：227-229.

[7]吕晓虹，何岚，施秉银，等.类风湿关节炎患者胰岛素抵抗状况的评价[J].西安交通大学学报(医学版)，2011，32(1)：89-92.

[8]刘才华.2型糖尿病患者血清TNF-α、瘦素及抵抗素水平与心脑血管并发症相关性[J].青岛大学医学院学报，2014，50(2)：136-138.

[9]聂玲玲，缪珩.低血糖与2型糖尿病[J].现代生物医学进展，2013(3)：582-586.

[10]Venn-Watson S，Smith CR，Stevenson S，et al.Blood-Based Indicators of Insulin Resistance and Metabolic Syndrome in Bottlenose Dolphins[J].Front Endocrinol (Lausanne)，2013，4：136.

[11]王华.地特胰岛素联合格列美脲对老年2型糖尿病患者胰岛素抵抗的影响[J].内蒙古中医学，2012，31(19)：19-20.

[12]Wojcik M，Zieleniak A，Mac-Marcjanek K，et al.The elevated gene expression level of the A(2B) adenosine receptor is associated with hyperglycemia in women with gestational diabetes mellitus[J].Diabetes Metab Res Rev，2014，30(1)：42-53.

[13]厉彦山，姜林娣.肿瘤坏死因子及其受体在类风湿关节炎中的作用[J].复旦学报，2010，7(2)：245-249.

[14]谢希，陈进伟，彭佑铭，等.抗肿瘤坏死因子-α治疗类风湿关节炎致感染风险的Meta分析[J].中南大学学报，2013，38(7)：722-736.

[15]刘儒曦，杨娉婷，方芳，等.肿瘤坏死因子-α拮抗剂治疗类风湿关节炎并发慢性疾病性贫血疗效研究[J].中国实用内科杂志，2013，33(1)：49-51.

[16]Sil R，Ray D，Chakraborti AS.Glycyrrhizin ameliorates insulin resistance，hyperglycemia，dyslipidemia and oxidative stress in fructoseinduced metabolic syndrome-X in rat model[J]. Indian J Exp Biol，2013，51(2)：129-138.

Experimental study on effect of anti-TNF-α antibody to alleviate the acute insulinresistance induced by stress hyperglycemia after traumatic infection

/QU Wei, ZHANG Jing, JIANG Zhao-shun, et al// China Medical Equipment,2014,11(8):4-7.

Objective: The objective of this study was to investigate the alleviating effect of TNF-α Antibody on acute insulin resistance induced by experimental stress hyperglycemia after traumatic infection. Methods: On stress hyperglycemia model of rats induced by sepsis, rats were randomly divided into groups, which were given antagonist therapy of high-dose or low-dose TNF-α. Then blood glucose, serum insulin level, glucose tolerance test and hyperinsulinemic euglycemic clamp test were used to evaluate the differences among the intervention groups. Results: Anti-TNF-α antibody could significantly reduce serum insulin levels, glucose tolerance, rate of glucose infusion and the phosphorylation level of AKt in liver tissue, meanwhile, it could also raise the phosphorylation level of mTOR. Conclusion: Therapy using Anti-TNF-α antibody could reduce the degree of acute insulin resistance after stress hyperglycemia induced by post-traumatic infection, which may adjust by the phosphorylation level of mTOR and AKt in signaling pathway of insulin metabolism.

Stress hyperglycemia; Rats; Anti-TNF-α antibody; Insulin resistance

1672-8270(2014)08-0004-04

R587

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.08.002

2014-05-28

中国博士后科学基金面上项目(20080441294)“抗TNF-a抗体对创伤感染应激性高血糖大鼠急性胰岛素抵抗的作用及机制”

△共同第一作者：张静 济南军区总医院干部一科 山东 济南 250031

①济南军区总医院内分泌科 山东 济南 250031

*通讯作者：zhaoshunjiang@sohu.com

曲卫，女，(1971- )，博士，主治医师。济南军区总医院内分泌科，研究方向：内分泌与代谢相关疾病。