非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯反应研究进展

林 凯，辛嘉英,2,*，王 艳，陈林林

（1.哈尔滨商业大学 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室， 甘肃 兰州 730000）

非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯反应研究进展

林 凯1，辛嘉英1,2,*，王 艳1，陈林林1

（1.哈尔滨商业大学 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室， 甘肃 兰州 730000）

长链脂肪酸淀粉酯作为改性淀粉的一种重要类型具有广泛的应用前景。酶作为生物催化剂在非水相中可对淀粉和长链脂肪酸进行酯化，该反应具有底物选择性高、产物专一性强、条件温和、产物可生物降解等优点。本文从酶催化合成反应的机理、酶法催化长链脂肪酸淀粉酯的制备方法、取代度的测定方面进行综述。

长链脂肪酸淀粉酯；酶催化反应；非水相；取代度

淀粉是一种大量存在的、廉价的、可再生的并且能够被生物完全降解的天然多聚糖[1]。由于天然淀粉的结构导致其反应活力和反应效率偏低，所以需要通过物理或者化学等方法对天然淀粉进行改性，以满足特定的需求[2]。长链脂肪酸淀粉酯作为改性淀粉的一种重要类型已广泛用于塑料工业、食品工业和生物医学等领域 。由于淀粉中引入了长链脂肪酸，使其具有不同于天然淀粉的特殊的热塑性、乳化性、疏水性和抗拉伸等特性。但是通过物理或化学方法制备长链脂肪酸淀粉酯的过程中，通常伴有副产物的产生，并且反应条件苛刻。因此越来越多的研究者对非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯的合成进行了研究。相比物理化学方法，非水相酶法催化对底物的选择性强[3]、反应条件温和[4]，并且抑制了依赖于水的副反应的发生[5]。鉴于研究的不断深入，本文就非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯的合成机理、方法以及取代度的测定进行系统的分析和综述。

1 非水相酶法催化合成的反应机理及其影响因素

用于脂肪酸淀粉酯合成的酶主要为脂肪酶，来自于南极假丝酵母（Candida antarctica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[6]。在非水相中进行的酶促反应，酯水解反应向着酯合成反应方向进行，从而使酶法催化合成长链脂肪酸淀粉酯成为可能[7]。脂肪酶多用于长链脂肪酸淀粉酯的合成，其反应机理为：酶的活性中心含有亲核基团（如丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基），这些基团都有共用的电子对作为电子的供体，与脂肪酸中羧基的碳原子即亲电子基团以共价键的方式结合，形成酰化酶中间产物，接着酰基从中间产物转移到另一酰基受体淀粉分子中，形成脂肪酸淀粉酯。反应历程如下：

式中：X为RCOO、OR、Cl、OH。

在非水相中，酶的催化活性受到很多因素的影响，包括有机溶剂、反应体系中水含量、利用酶的方式等[8]。在水相体系中，酶表面极性带电荷的氨基酸侧链能与水分子相互作用，使酶分子有较大的催化表面积，而在疏水性有机溶液中，这些氨基酸侧链会转向酶分子内部，在酶分子表面高度包裹，减少酶分子的可溶表面积，降低酶催化的柔韧性，从而抑制了酶的催化活性[9]。在非水相酶催化反应中水含量也是影响酶催化活性的重要因素，正是由于在微观上酶分子表面这层微观水的存在，才使得宏观上非水相体系中酶具有催化活性。水分子的存在可以通过氢键、疏水键等作用力维持酶分子的催化构象[10]。对于亲水性的有机溶剂，会吸附酶分子表面的必须水，使得酶分子变为刚性状态，失去酶催化构象的柔韧性[11]。因此反应体系中适当的水含量是必须的。同时，酶的利用形式也会影响其催化活性及耐受性。酶在非水相中的利用方式主要有3种方式：酶的化学修饰、酶的固定化以及酶的定点突变。酶的化学修饰是 利用戊二醛或聚乙二醇与酶进行化学交联，得到交联酶晶体，提高酶分子在有机相中的溶解性和稳定性，同时能提高反应活性[12]；酶的固定化是用载体将酶固定在特定的区域，使得酶仍具有催化活性，并且可以重复利用。研究发现，除了具有普通酶的性质外，酶的固定化使其在有机溶剂中的稳定性提高[13]；酶的定点突变是用分子生物学的方法定向改造酶分子的结构，并通过高通量筛选出有机溶剂耐受性酶，提高酶在非水溶剂中活性和催化能力[14]。

2 非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯的合成方法

脂肪酶催化长链脂肪酸与淀粉发生酯化是一个复杂的反应体系，该反应体系应考虑长链脂肪酸的疏水性、淀粉的亲水性、酶在反应体系中的催化活性这三方面因素。长链脂肪酸、淀粉和脂肪酶在反应体系中的状态决定了酯化反应能否发生。下面将以不同体系下非水相酶法催化长链脂肪酸淀粉酯的合成分别加以论述。

2.1 无溶剂体系

若脂肪酸在室温或在低温加热状态下为液体，以脂肪酸为溶剂体系，脂肪酶可直接催化酯化反应的发生。由于底物浓度高，该方法提高了反应的转化率。Horchania等[15]以CaCO3为载体对Staphylococcus aureus脂肪酶（SAL3）进行固定化，以微波加热的方式，通过液态酯化的方式合成油酸淀粉酯，并通过响应面法对实验结果进行优化。在淀粉/油酸质量比为0.18，固定化脂肪酶单位为386 U条件下，44℃反应4 h，制得取代度为2.86的油酸淀粉酯。经α-淀粉水解酶实验发现，通过疏水化修饰后，油酸淀粉酯降解性降低。因为淀粉颗粒由结晶区和无定形区组成，结晶区结构致密，限制酶分子向淀粉内部的渗透，导致其取代度和反应效率降低。因此可以使用物理、化学和生物降解的方法对淀粉进行预处理，破坏淀粉的结晶结构，从而提高反应效率[2]。Xin Jiaying等[16]用NaOH/尿素对玉米淀粉进行预处理，通过电镜分析，与原淀粉相比，处理后的淀粉颗粒体积更小，表面粗糙并且疏松多孔。通过红外光谱进一步分析，原淀粉经预处理后，在1 661～1 623 cm-1之间出现C＝O的特征吸收峰，这是由于淀粉分子链的断 裂从而导致羰基增多。同时在992 cm-1附近，D-吡喃葡萄糖环中C－O－C基团上的C－O伸缩振动峰发生红移，这将会减轻淀粉分子间氢键的相互作用，使得淀粉链节发生断裂[17]。淀粉分子结构的变化使得酶分子与酯化剂更容易接近淀粉分子，从而提高催化效率。实验证明，在无溶剂体系下，以固定化脂肪酶Novozym 435为催化剂，以棕榈酸和预处理淀粉为原料，合成了棕榈酸玉米淀粉酯，通过气相色谱（gas chromatography，GC）法测定其取代度为1.04。王艳等[18]也用NaOH/尿素对玉米淀粉进行预处理，在无溶剂体系下制得了取代度为0.201的油酸淀粉酯。但采用无溶剂体系催化反应合成时应该考虑各反应底物的含水量，防止该反应体系向水解反应方向进行。同时淀粉不易溶于非极性溶剂，所以淀粉在该反应体系中的扩散及溶解程度也是影响催化效率的重要因素。由于无溶剂体系法没有添加任何有机溶剂，反应制得的产品可直接用于食品、医药等领域。

2.2 反胶束体系

反胶束体系是表面活性剂溶解于非极性溶液中，形成非极性环境围绕极性核的反应体系，即油包水型（W/O）微乳液[5]。该方法是在脂肪酶表面吸附少量的表面活性剂，表面活性剂的用量不应将酶的表面全部覆盖，形成脂肪酶-表面活性剂离子对，增加了脂肪酶在以 有机溶剂为反应体系中的溶解性，形成反胶束，催化酯化反应的发生。Bruno等[19]在以异戊烷为有机溶剂的反应体系中，加入通过相转移法制成的枯草蛋白酶-2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（bis（2-ethylhexyl）sulfosuccinate sodium salt，AOT）离子对，催化葵酸乙酯与淀粉的转酯化反应。通过热重量分析法测定，制得的葵酸淀粉酯的取代度为0.15～0.32。通过光电子能谱发现，酯化反应优先发生在淀粉颗粒的表面。研究进一步发现，使用未经预处理的酶直接加入到该反应体系时，并没有发生酯化反应。Alissandrato等[20]利用脂肪酶-表面活性剂离子对在异戊烷有机相中，催化合成了末端带有三键的己炔酸淀粉酯，并且通过末端的三键与带有荧光的叠氮化物进行环加成反应，生成具有荧光性的淀粉酯。通过荧光显微镜观察到该荧光物质，进一步证明了己炔酸淀粉酯的生成。Chakraborty等[21]将淀粉制成平均粒径在40 μm的纳米淀粉颗粒，并与酰基供体形成AOT-微乳液，以固定化脂肪酶Novozym 435为催化剂，在40℃条件下反应48 h，制得取代度为0.8的硬脂酸淀粉酯。通过同位素比质谱仪发现，尽管固定化脂肪酶存在于大孔树脂的内部，但是纳米淀粉颗粒还是与脂肪酶发生接触，并成功催化了反应的发生。

2.3 有机溶剂体系

淀粉不溶于绝大多数的液体，但是可溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、N,N-二甲基乙酰胺（N,N-dimethylacetamide，DMAc）和吡啶等强极性有机溶剂中。与淀粉的糊化作用不同，淀粉颗粒在DMSO中并未发生膨胀。淀粉链节的断裂主要是由于DMSO是一种极强的氢键受体，能使淀粉分子内部的氢键发生断裂。但DMSO也会对酶分子的天然构象产生不利影响，使得酶分子内部的氢键发生断裂，破坏其二级结构，使酶分子失去催化活性。同时，DMSO也有较强的吸湿性，在反应过程中应控制体系中适当的水活度，维持酶分子具有催化活性所必需的构象。在极性溶剂中可对酶进行修饰，提高酶催化的稳定性[22]。Ge Jun等[23]认为在催化反应的过程中酶分子应受到保护。他们将脂肪酶包裹在聚丙烯酰胺纳米凝胶中。通过分子仿真技术和结构分析发现：在DMSO溶剂中，聚丙烯酰胺纳米凝胶有效地防止了酶分子中必需水的渗出，保持了酶分子的天然构象。实验进一步通过电子荧光显微镜证实，脂肪酶-纳米凝胶在DMSO中也具有良好的分散性。Rajan等[24]在DMSO/DMF有机溶剂的反应体系中，70℃反应4 h，以脂肪酶为催化剂催化了木薯淀粉 和棕榈酸的合成反应，通过皂化法测得取代度为1.05，并根据红外光谱的测定证实了酯化反应的发生。通过热接重量实验分析和黏度的测定，随着长链棕榈酸的引入，热稳定性和黏度与原淀粉相比增大。同时棕榈酸的引入使得棕榈酸淀粉酯具有热塑性，可以广泛地应用于塑料工业。

2.4 离子液体系

与DMSO相似，离子液作为一种有机溶剂的替代品应用广泛。离子液在室温下呈现液态的熔盐，蒸汽压低，不易挥发。在催化多糖类物质如淀粉的酯化方面表现较高的活性[25]。Liu Qingbin等[26]研究发现：脂肪酶在离子液中可保持催化活力，可以催化酯化反应的发生，但是淀粉仅微溶于离子液，在实验中并没有发生预想的反应。同时由于离子液在室温下呈现液态的熔融盐，挥发性低，不利于产物的分离。为了克服离子液的这些缺点，Lee等[27]研究了含有氯离子的离子混合液，由于这种离子混合液有极强的亲水性，淀粉的溶解性增强，却抑制了酶的催化活性。因此使用新型离子液时应考虑到淀粉的溶解性和酶的催化活力两方面因素。离子液作为溶剂体系还有待于进一步研究。

3 取代度的测定

长链脂肪酸淀粉酯的理化性质取决于取代度、脂肪链饱和度与碳链长度及直链/支链淀粉酯的含量等。其中取代度的大小是长链脂肪酸淀粉酯的理化性质的主要因素。传统测定取代度的方法是皂化-反滴定法，这种方法首先是由Genung等[28]提出的，滴定法的基本原理是：当酯化改性淀粉在一定量的热氢氧化钠溶液中发生皂化反应时，酯键发生断裂生成游离的酰基，游离的酰基与钠离子形成酰基钠。当用标准盐酸溶液对皂化反应物进行反滴定时，通过计算皂化反应消耗的氢氧化钠的量推导出发生酯化反应的酰基的量。现在这种方法仍被广泛的应用[29-33]。

随着现代仪器分析的发展，测定取代度准确度也进一步提升。目前，测定取代度的方法有气相色谱法、核磁共振法和元素分析法。Alissandratos等[34]先将制得的脂肪酸淀粉酯溶于DMSO，然后加入甲醇钠-甲醇溶液，冷凝回流，通过转酯反应生成脂肪酸甲酯，然后加入内标物，进行GC分析。研究发现，通过重复实验，这种方法实验偏差低于3%，其中测定的一种脂肪酸淀粉酯的取代度可达到0.004 2±0.000 1。相比于传统方法，GC法提供了一种重现性更好、准确度更高、分析速度更快的方法。同时研究者还发现，这种方法更适合测定中长链的脂肪酸淀粉酯。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法是通过测定脂肪链中－CH3上H和葡萄糖上质子H在1H NMR图谱上峰面积的特定比值从而确定脂肪酸淀粉酯的取代度。Elomaa等[35]在用NMR法测定时发现，这种方法适用于取代度大于2的脂肪酸淀粉酯的测定。Forrest等[36]利用傅氏转换红外线光谱分析仪（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）测定了羟丙基淀粉的取代度，研究发现采用红外光谱法测定取代度，样品可以直接测定，提高准确度，同时该方法对其他多糖类物质的测定也适用。

4 展 望

近年来，长链脂肪酸淀粉酯作为脂肪替代品、缓释药物载体和具有良好热塑性的生物降解材料在各领域已有广泛应用。随着研究的不断深入，权衡淀粉、酶和长链脂肪酸这三者的关系，找到一个适合的反应条件，以及提高酶法催化长链脂肪酸淀粉酯取代度问题都将成为未来的研究热点，并且随着可利用的酶的种类增多，会使酶法催化长链脂肪酸淀粉酯有更广阔的发展空间。

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Recent Progress in Lipase-Catalyzed Synthesis of Long-Chain Fatty Acid Starch Esters in Non-Aqueous Phase

LIN Kai1, XIN Jia-ying1,2,*, WANG Yan1, CHEN Lin-lin1
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. State Key Laboratory of Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

Long-chain fatty acid starch esters, an important kind of modified starch products, have attractive application prospects. It is well known that the application of non-aqueous enzymatic catalysis in esterification of starch with long-chain fatty acids has the advantages of higher substrate selectivity, suppression of unwanted water-dependent side reactions, mild reaction conditions and biodegradability. In this review, the reaction mechanism and the currently available methods for lipase-catalyzed synthesis of starch esters with long-chain fatty acids in non-aqueous phase and the recent progress in the determination of degree of substitution are discussed.

long-chain fatty acid starch esters; enzymatic catalysis; non-aqueous phase; degree of substitution

TS231

A

1002-6630（2014）03-0276-04

10.7506/spkx1002-6630-201403054

2013-02-27

黑龙江省杰出青年基金项目（jc201106）；黑龙江省教育厅科技创新团队计划项目（2010td04）

林凯（1989—），男，硕士研究生，研究方向为生物催化。E-mail：glklkk@126.com

*通信作者：辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向为生物催化。E-mail：xinjiayingvip@163.com