适于解淀粉芽孢杆菌BGP20菌体生长的培养基响应面优化

赵延存，李鹏霞，黄开红*，王毓宁，孙 娅，胡花丽

（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）

适于解淀粉芽孢杆菌BGP20菌体生长的培养基响应面优化

赵延存，李鹏霞，黄开红*，王毓宁，孙 娅，胡花丽

（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）

为获得解淀粉芽孢杆菌BGP20的低成本高效菌体生长培养基配方，利用响应面试验设计和摇瓶发酵对培养基各组分进行优化。根据单因素试验和Plackett-Burman设计试验结果确定了豆粕和玉米淀粉为主要因素。以发酵培养液菌体密度为响应值，利用Design-Expert软件的中心组合试验设计进行优化，并对预测值进行验证。结果表明：回归方程具有很好的拟合性，培养基最优配比为豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素 15 mL/L，获得BGP20发酵液菌体密度为1.86×109CFU/mL，模型预测最高值为1.985×109CFU/mL，验证实验结果为预测值的93.72%，说明该模型对实际生产具有指导意义。

解淀粉芽孢杆菌；发酵培养基；菌体密度；响应面设计；回归模型

采收后蔬菜特别容易腐烂变质，包括在贮藏、运输、货架和消费者保藏期间[1]。植物病原菌是导致采后蔬菜腐败变质的主要原因，在适宜的条件下迅速引起蔬菜腐烂，并产生各种危害人体健康的有毒物质[1-3]。其中，细菌性软腐病是引起采后蔬菜腐烂变质的主要病害之一，特别是对采后辣椒和大白菜，病原菌是胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，Ecc）[2,4]。目前，该病害的控制主要依靠化学杀菌剂和抗生素，例如次氯酸盐、福尔马林、氯霉素等[4]。近年来，人们对食品安全和环境质量的要求日益提高，化学杀菌剂和抗生素在采后农产品上的使用被严格限制或禁止，这就促使研究者开发更加安全的采后果蔬防腐保鲜技术。基于微生物的生物防控技术被认为是未来果蔬采后保鲜技术发展方向之一[1,5-6]，例如芽孢杆菌（Bacillus species）[7-9]。

在前期研究中，本课题组从土壤中分离到一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum）BGP20，该菌对采后蔬菜细菌性软腐病表现出良好的生防效果[10]。生防菌BGP20主要通过与病原菌Ecc竞争蔬菜伤口的营养和空间，从而阻止病原菌侵染和减缓病害的发展；另外，BGP20产生的次生代谢产物也对Ecc具有较高的拮抗活性[10]。低成本高产发酵培养基的筛选是优良生防菌株能够在农业生产上大规模应用的前提条件，是建立其工业发酵体系的基础[11-13]。本研究利用响应面分析方法（response surface methodology，RSM）对解淀粉芽孢杆菌BGP20的发酵培养基组分进行了筛选和优化。

1 材料与方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢杆菌BGP20菌株由本研究室分离、鉴定并保存，其16S rRNA和gyrB基因序列已提交GenBank数据库，序列号分别为JQ734535和JQ734538。

1.2 种子菌的准备

将保存于－80 ℃条件下的甘油BGP20菌种在2YT（蛋白胨17 g/L、NaCl 5 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH 7.0）琼脂平板上划线活化，用灭菌牙签挑取单菌落转接到装有50 L 2YT液体培养基的250 L三角瓶内，在30 ℃、150 r/min条件下振荡培养18 h。

1.3 单因素试验

1.3.1 最优氮源的筛选

以Landy培养基（L-谷氨酸5 g/L、酵母浸膏 1 g/L、L-苯丙氨酸 2 mg/L、葡萄糖 20 g/L、KH2PO41 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L，pH 7.0）为基础培养。分别使用以下氮源替换Landy培养基中的氮源（L-谷氨酸和酵母浸膏）：NH4Cl 5 g/L、(NH4)2SO45 g/L、酵母浸膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、L-谷氨酸10 g/L、43%豆粕10 g/L。

1.3.2 最优碳源的筛选

以Landy为基础培养基，分别使用以下碳源替换Landy培养基中的葡萄糖：葡萄糖 10 g/L、蔗糖10 g/L、麦芽糖10 g/L、果糖10 g/L、可溶性淀粉10 g/L、玉米淀粉10 g/L。

1.3.3 不同金属离子对BGP20摇瓶发酵的影响

基础培养基：蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖 10 g/L，pH 7.0。分别向基础培养基中添加FeSO4·7H2O 100 mg/L、CuSO4·5H2O 100 mg/L、MnSO4100 mg/L、ZnSO4·7H2O 100 mg/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、CaCl21 g/L，痕量元素（包含ZnSO4·7H2O 0.14 mg/L、FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L）。

以上培养基的初始pH值均调整为7.0，分别将种子菌液按照体积分数1%的比例接种于装有25 L已灭菌培养基的150 L三角瓶内。然后，30 ℃、150 r/min振荡培养24 h，梯度稀释，涂布2YT琼脂平板，30 ℃条件下静置培养16 h，统计单菌落个数[14]。

BGP20发酵液对病原菌Ecc拮抗活性的测定，按照Zhao等[10]描述的方法进行。

1.4 Plackett-Burman试验设计

利用Plackett-Burman设计方法对单因素试验筛选的6种因素的重要性进行评估[15-16]，筛选影响BGP20发酵菌体密度的重要因素，确定培养基的最佳组分。Plackett-Burman试验设计方案见表1。

表1 利用Plackett-Burman 设计筛选培养基的重要组分Table 1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman dessiiggnn

1.5 最陡爬坡试验

依据Plackett-Burman试验获得的一次拟合方程，确定各重要因素的爬坡方向和步长变化，设计最陡爬坡试验[16]。

1.6 中心组合设计和响应面分析

基于Plackett-Burman和最陡爬坡试验确定的重要因子中心点，利用中心组合设计（central composite design，CCD）软件生成响应面分析试验方案[17]。

1.7 响应面模型的验证

按照获得的二次回归方程所预测的最佳组分配比配制发酵培养基，通过摇瓶发酵实验，验证模型的有效性。另外，在上述发酵条件下，比较BGP20在最优化培养基与Landy和2YT培养基中的生长动态，分别测定各培养基发酵液在24 h和36 h时对病原菌Ecc的拮抗活性。

1.8 数据分析

每个处理包含3个独立的重复，结果是3个重复实验的平均值。利用Design-Expert 7.0软件进行Plackett-Burman试验和CCD响应面分析[18]。利用SPSS 13.0软件对单因素试验和最佳培养基验证实验的结果进行统计分析，采用Tukey’s测验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素筛选结果

2.1.1 氮源

表2 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液菌体密度和拮抗活性的影响Table 2 Effect of different nitrogen sources on cell growth and antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表2可知，氮源是影响BGP20发酵液菌体密度和拮抗活性的重要因素，特别是对BGP20的发酵液菌体密度。豆粕发酵液菌体密度最大，是对照培养基Landy的5.24倍，顺序依次为豆粕＞酵母浸膏＞蛋白胨＞牛肉浸膏＞对照＞(NH4)2SO4＞L-谷氨酸＞NH4Cl。对照产生的拮抗圈最大，其次为蛋白胨和豆粕，其中豆粕为对照的93.7%。各处理BGP20的菌体密度与其拮抗活性不呈正相关。另外，研究发现BGP20在速效有机氮源（酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、L-谷氨酸）培养基中生长24 h时，培养基变的比较黏稠，表明BGP20在该类培养基中产生了大量胞外多糖等次生代谢产物，但是以豆粕为氮源的培养基不黏稠。以上结果表明，胞外多糖等次生代谢产物的大量合成限制了BGP20的增殖。

2.1.2 碳源

表3 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液菌体密度和拮抗活性的影响TTaabbllee 33 EEffffeecctt ooff ddiiffffeerreenntt ccaarrbboonn ssoouurrcceess oonn cceellll ggrroowwtthh aanndd antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表3可知，测定的6种碳源中，玉米淀粉的发酵菌体密度最高，但是与对照、可溶性淀粉、葡萄糖和麦芽糖差异不显著。对照的拮抗活性最高，顺序依次为对照＞玉米淀粉、麦芽糖＞葡萄糖、可溶性淀粉＞果糖＞蔗糖，其中，玉米淀粉为对照的94.8%。

2.1.3 不同金属离子

由表4可知，金属离子对BGP20的生长影响较大，并且各离子之间存在协同促进作用。与对照相比，MgSO4·7H2O对BGP20菌体生长速度的促进作用最大，其次是NaCl；痕量元素和KH2PO4与对照相比差异不显著；但是，其他金属盐对BGP20的生长具有显著抑制作用。与BGP20的生物量相比，金属盐对发酵液拮抗活性的影响相对较小，仅NaCl显著优于对照，痕量元素、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CuSO4·5H2O、MnSO4和CaCl2与对照差异不显著。综合考虑菌体密度和拮抗活性，MgSO4·7H2O、NaCl、痕量元素和KH2PO4对BGP20的发酵都有正向效应。

表4 不同金属离子对解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液菌体密度及拮抗活性的影响Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

表4 不同金属离子对解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液菌体密度及拮抗活性的影响Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

注：对照培养基为蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

金属离子 菌体产量/（107CFU/mL） 拮抗圈直径/mm对照 20.2±2.5de 11.0±0.5cdeFeSO4·7H2O 1.4±0.2ab 10.1±0.6abCuSO4·5H2O 1.0±0.1a 10.8±0.6bcdMnSO4 1.6±0.0b 10.7±0.5bcZnSO4·7H2O 1.6±0.1b 9.4±0.4aMgSO4·7H2O 29.2±1.2f 11.7±0.5deKH2PO4 20.1±1.8d 11.2±0.4cdeNaCl 28.2±1.1f 12.0±0.5fCaCl2 5.5±0.8c 10.6±0.6bc痕量元素 23.5±1.4def 11.8±0.3ef

2.2 利用Plackett-Burman设计筛选关键培养基组分

表5 Plackett-Burman试验设计及其结果Table 5 Plackett-Burman design and corresponding results

Plackett-Burman试验结果见表5，每一行代表一个试验，每一列代表一个变量。利用Design-Expert软件对Plackett-Burman试验结果进行方差分析（表6），6种组分中，只有豆粕和玉米淀粉的添加量显著影响了BGP20的发酵液菌体密度（P＜0.05），P值分别为0.000 4和0.010 2，其他因素的影响都没有达到显著水平（P＞0.05）。在实验设定变量范围内，豆粕呈现正效应（β1= 1.628×108），玉米淀粉呈现负效应（β2= －7.722×107）。

表6 Plackett-Burman筛选试验的方差分析Table 6 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

利用Design-Expert软件进行回归分析，获得各因素对BGP20发酵菌体密度影响的一次回归方程：

方程的F和P值分别为15.44和0.004 3，表明回归方程式（1）是显著的（P＜0.01）。R2=0.948 8，表明这个方程能够解释变量响应值的94.88%。R2Adj高达0.887 3，表明这个方程的拟合程度较好。以上结果表明，回归方程式（1）为Plackett-Burman设计试验提供了一个合适的模型。

2.3 最陡爬坡试验结果

根据回归方程式（1）中豆粕和玉米淀粉的变量系数（1.628×108和－7.722×107）可知，两者的比值接近1∶（－0.5），即豆粕每增加1 g/L，玉米淀粉就降低0.5 g/L。培养基中MgSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4和痕量元素的含量选定为中心水平，依次为0.75 g/L、1.25 g/L、0.75 g/L和15 mL/L。最陡爬坡试验设计及结果见表7，结果表明，豆粕和玉米淀粉分别为15 g/L和6 g/L时菌体密度最大，因此，选择该组配比为下一步中心组合试验的中心点。

表7 最陡爬坡试验设计及结果Table 7 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 中心组合试验和响应面分析

2.4.1 二次多项式回归模型的建立

根据爬坡试验获得的中心点进行中心组合试验设计，结果见表8。利用Design-Expert软件对试验结果进行方差分析（表9），结果表明X1、X12和X22项呈极显著水平（P＜0.01），P值依次为＜0.000 1、＜0.000 1、0.002 2；X2和X1X2项呈显著水平（P＜0.05），P值分别为0.046 8和0.041 5。利用Design-Expert软件进行回归分析，获得豆粕和玉米淀粉对BGP20发酵菌体密度影响的二次回归方程：

方程的F = 54.79和P＜0.000 1，表明回归方程式（2）是显著的（P＜0.01）。R2=0.975 1，表明这个方程能够解释变量响应值的97.51%。R2Adj高达0.863 2，表明这个方程的拟合程度较好。失拟项的F和P值分别为3.23和0.143 6，不显著（P＞0.05）。以上结果表明，回归方程（式（2））为这个中心组合试验提供了一个合适的模型。

表8 中心组合设计及试验结果Table 8 Central composition design and corresponding results

表9 中心组合试验的方差分析Table 9 Analysis of variance for the experimental results of central composition dessiiggnn

2.4.2 响应面分析

图1 豆粕和玉米淀粉对于BGP20菌体发酵密度的响应面和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of defatted soy flour and cornstarch on cell growth of BGP20

基于中心组合试验结果，获得响应面模型的三维图和等高线图。由图1可知，在实验设置的变量范围内有一个最高点，即BGP20发酵液菌体密度有最大响应值。当豆粕的添加量为16.03 g/L，玉米淀粉添加量为6.30 g/L时，BGP20发酵液菌体密度达到最大预测响应值1.985×109CFU/mL。

2.5 预测模型的摇瓶发酵验证

图2 BGP20在3种不同培养基中的生长动态（A）及拮抗活性（B）Fig.2 Growth dynamics (A) and antagonistic activity (B) of BGP20 in three different media

为了验证获得的二次多项式模型（2），选择模型预测最高点的培养基组分（豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，pH 7.0）进行摇瓶发酵验证。Landy和2YT培养基是培养芽孢杆菌的常用培养[10,19]，将上述最优配比培养基与这两种培养基的发酵效果进行比较，结果见图2。利用最优配比培养基发酵24 h时的BGP20菌体密度为1.86×109CFU/mL，是模型（2）预测值的93.72%，与预测值基本吻合。在发酵12 h以后，最优配比培养基的BGP20菌体生长速度明显高于Landy和2YT培养基，在36 h时达到最高值（2.55×109CFU/mL），分别为Landy和2YT培养基的4.73倍和2.82倍（图2A）。在摇菌发酵的中后期，Landy和2YT培养基变得比较黏稠，说明BGP20产生了大量胞外多糖等次生代谢产物，这些次生代谢产物可能导致了BGP20增殖缓慢或停止；但是，最优配比培养基不利于胞外多糖等次生代谢产物的产生，BGP20可以持续的增殖，并达到较高的发酵菌体密度。另外，3种培养基发酵液的拮抗活性在11.5～12.7 mm，其间差异不显著（图2B）。

3 结 论

首先，在单因素试验的基础上，利用Plackett-Burman设计试验确定了BGP20发酵培养基的组分，其中豆粕和玉米淀粉是关键因子；其次，根据最陡爬坡试验确定了关键因子中心点和步长，利用Design-Expert软件对中心组合试验的结果进行分析，建立了BGP20发酵培养的模型：= 1.951×109＋2.266×108X1＋ 6.752×107X2－9.875×107X1X2－4.120×108X12－1.413×108X22。分析发现该回归方程在实验测定范围内有最大值，即得到了BGP20发酵培养基的最优配比：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，此培养基组分的BGP20发酵液菌体密度预测值为1.985×109CFU/mL；最后，对最优配比组分进行验证，获得的BGP20发酵液菌体密度为1.86×109CFU/mL，是预测值的93.72%，两者基本吻合，说明模型是可行的。并且，最优配比培养基显著优于Landy和2YT培养基。

另外，本研究发现速效有机氮源有利于BGP20的早期生长，但是在中后期BGP20大量合成胞外多糖等次生代谢产物，增殖速度受到限制。缓释氮源豆粕培养基产生较少的胞外多糖等次生代谢产物，有利于BGP20的持续增殖，并最终达到一个较高的发酵菌体密度。各种碳源对BGP20发酵液菌体密度影响相对较少，但是过高的玉米淀粉含量也导致BGP20在发酵的中后期产生大量胞外多糖等次生代谢产物，不利于其增殖。本研究还发现痕量元素的添加能够显著提高BGP20发酵液菌体密度。

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Response Surface Optimization of Medium Components for Cell Growth of Bacillus amyloliquefaciens BGP20

ZHAO Yan-cun, LI Peng-xia, HUANG Kai-hong*, WANG Yu-ning, SUN Ya, HU Hua-li
(Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A cost-effective culture medium for shake flask fermentation of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BGP20 was developed by optimizing the medium components using response surface methodology. First, based on the results of univariate analysis and Plackett-Burman design experiments, defatted soy flour and cornstarch were identified as two key medium components. Then a central composite design was applied to fit the relationship between these two components and optimal levels of BGP20 cell growth. The results showed that the regression model had a high fitting degree. The optimal medium components were 16.03 g/L defatted soy flour, 6.30 g/L cornstarch, 0.75 g/L MgSO4·7H2O, 1.25 g/L NaCl, 0.75 g/L KH2PO4and 15 mL/L trace elements. The maximum predicted value from the regression model was 1.985 × 109CFU/mL, and the actual value observed in validation experiments was 93.72% as compared to the predicted value. These results demonstrate that the regression model is of great guiding significance for commercial fermentation of BGP20.

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum; fermentation medium; cell concentration; response surface methodology; regression model

S476.8；TQ920

A

1002-6630（2014）03-0157-06

10.7506/spkx1002-6630-201403032

2012-12-19

2011年度第二批“江苏省博士后科研资助计划”项目；江苏省农业科学院博士后基金项目（6511106）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（12）3081）

赵延存（1976—），男，助理研究员，博士后，研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail：zhaoyc27@126.com

*通信作者：黄开红（1955—），男，研究员，硕士，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：jaashuang@hotmail.com