赤霉素萃余液降解微生物的分离筛选及其降解COD的研究

张金儿，刘义雄，毛玉华，朱江萍，叶晓斌，肖 芳，涂国全

（江西新瑞丰生化有限公司，江西 新干331307）

赤霉素是植物五大激素之一，主要由藤仓赤霉菌及其变种通过液体深层有氧发酵而得。赤霉素萃余液是赤霉素浓缩液经溶媒萃取后的高浓度有机废液，具有显著的“三高”特点：高酸性（pH值≤2.2）、高盐（盐浓度≥10%）、超高有机浓度（≥100 000mg·L－1），一般菌在此废液中难以存活［1］。

利用酵母菌和乳酸菌混合发酵降解赤霉素萃余液中COD的技术路线初步可行［1］，但降解效果并不理想。作者在此通过富集培养筛选得到“三耐”（耐酸、耐盐、耐高浓度有机物）的高效降解赤霉素萃余液的不同类型的微生物（菌或菌群），并通过不同类型微生物的科学配伍进行免蒸静止连续发酵，对赤霉素萃余液进行高效降解，拟为抗生素发酵萃余液的处理开辟新途径，具有重要的理论研究和实际应用价值。

1 实验

1.1 材料

赤霉素萃余液，江西新瑞丰生化有限公司；xm＃菌，江西农业大学生物工程学院。

1.2 方法

1.2.1 定向富集培养分离筛选流程（图1）

1.2.2 土样采集

图1 定向富集培养分离筛选流程Fig.1 Process of redirect enrichment，isolation and screening

分别从长期堆放赤霉素发酵液滤渣场地、稻田、环保污泥、小便池及营养丰富的土壤等地深20cm处取土壤500g左右，装于牛皮纸信封或塑料袋中，记录土样来源并编号。将采集的土样于37℃培养烘干，然后用木棒将烘干土样压成粉末，备用。

1.2.3 不同pH值赤霉素萃余液的制备与分装

取赤霉素萃余液3份，缓慢加入6mol·L－1NaOH溶液，分别调pH值为5.0、6.0和7.0，等量分装于若干小试管中。

1.2.4 富集培养

1）第一次富集培养

每次做20个土样。每个土样取1g左右放入上述试管内，用棉塞塞试管口。其中pH值5.0、6.0、7.0各接种3支，分别置于20℃、28℃和37℃温箱中培养4～6d后观察培养液的颜色并检测pH值。以不接种土样为对照。分别对颜色和pH值变化显著的富集管取样涂片进行显微观察，以确定培养液中是否有微生物并初步确定是细菌、放线菌、霉菌还是酵母菌。将颜色和pH值无明显变化的富集管弃去。

2）第二次富集培养

分别取第一次富集培养中确定有微生物的富集液接种于对应的pH值培养液中，在对应的培养温度下进行第二次富集培养，3～4d后观察培养液的颜色、检测pH值，并进行镜检。

3）第三次富集培养

取第二次富集液同法进行第三次富集培养。

1.2.5 分离

1）稀释平板分离

将第三次富集培养液中经镜检有菌的试管用10倍稀释法稀释到适当的浓度后接种到对应的pH值平板分离培养基上，摇匀后置于对应的温度下培养至肉眼可见单菌落。

2）单菌落斜面或液体管的培养

将细菌、放线菌、酵母菌或霉菌的单菌落分别接种至对应的pH值斜面培养基上，编号并置于对应的温度下培养至菌苔丰满后，置于4℃冰箱中保藏备用。

1.2.6 筛选

在250mL三角瓶中分别装入pH值为5.0、6.0、7.0的赤霉素萃余液100mL，进行高效菌株的初筛和复筛。

1）初筛

每个菌落斜面接种一瓶，置于相应的温度下静止培养5～8d后观察培养液的颜色变化，闻气味，检测培养前后的pH值、COD值和固含量。选取pH值、COD值变化较大的菌株为初筛入选菌株，弃去pH值、COD值变化不大的菌株。

2）复筛

将每株初筛入选菌接种3瓶，筛选方法与初筛相同。选取pH值变化大、COD值下降率达到40%以上的菌株为复筛入选菌株。分别将复筛入选菌株进行扩培和菌种保藏，以便进行菌株间的科学配伍和赤霉素萃余液COD降解工艺研究。

1.2.7 免蒸静止连续发酵

1）小试

在250mL三角瓶中装入pH值为6.0的赤霉素萃余液100mL，按10%～15%的接种量分别接入筛选所得单株高效菌或配伍菌，在28～32℃发酵，从41h开始取样检测COD值、固含量和pH值。

2）中试

在100L发酵罐中加入80LpH值为6.0左右的赤霉素萃余液，在28～32℃发酵，接种后2d内少量通气，2d后停止通气，每天搅拌3～4次，每次10 min。接种量和检测项目与小试相同。

1.2.8 分析检测

颜色：目测。

pH值：采用pH酸度计测定。

菌体形态：涂片染色，在普通光学显微镜下观察。

固含量：采用离心沉淀法测定，于4 000r·min－1离心10min，按下式计算固含量：

COD值：于4 000r·min－1离心10min，取上清液测定［2］。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离筛选结果

对近200个土样进行富集培养、平板分离及摇瓶初筛及复筛，共获得多株“三耐”高效分解赤霉素萃余液的不同类型的菌株。几株高效菌复筛过程中的培养温度、培养时间及发酵前后培养液颜色、pH值、COD值见表1，显微照片见图1。

从表1可知：几株高效菌的单一降解效果可达42.55%～49.46%；发酵后pH值均有所回升，6＃菌升到7.0以上，而7＃、8＃菌都升到8.0以上。

从图1可知，除8＃地衣为细菌外，其它3株菌均为酵母菌。

2.2 免蒸静止连续发酵小试结果

对3株高效菌（6＃、8＃、xm＃）和相互配伍菌进行赤霉素萃余液免蒸静止连续发酵降解COD小试实验，结果见表2。

从表2可知：单一菌的降解效果不及配伍菌；以8＃地衣单一菌接种发酵时，其COD下降率不到50%；但和6＃酵母及xm＃酵母配伍时，COD下降率升高到60%以上，降解效果明显改善。这可能是因为，起始pH值偏低，地衣繁殖慢；而配伍后，由于酵母菌大量繁殖产生乙醇致使pH值上升促进了地衣的繁殖，配伍菌随之大量生长繁殖，改善了降解效果，COD下降率达60%以上。

表1 几株赤霉素萃余液高效降解菌摇瓶复筛结果Tab.1 The shake flask screening results of high－efficient gibberellins raffinate－degrading bacteria

图1 几株赤霉素萃余液高效降解菌的显微照片（×1600）Fig.1 The micrographs of high－efficient gibberellins raffinate－degrading bacteria（×1600）

表2 高效菌的免蒸静止连续发酵降解COD小试结果Tab.2 The degradation rate of COD of free autoclaved static continuous fermentation results for high－efficient bacteria

2.3 免蒸静止连续发酵中试结果

对xm＃＋6＃＋8＃配伍菌的赤霉素萃余液进行100L罐免蒸静止连续发酵降解COD中试实验，结果见表3。

从表3可知，100L罐中试实验的COD降解效果能重现小试水平，COD下降率达到60%以上；pH值和固含量都是先降后升再缓慢下降。

3 结论

（1）通过定向富集培养、分离筛选，获得多株“三耐”高效降解赤霉素萃余液COD的酵母菌和细菌，利用酵母菌和细菌的协同作用，且不需另外添加饴糖等碳源，萃余液COD降解率达到60%以上。

（2）采用定向富集培养、分离筛选所得高效菌混合发酵，COD一次降解率比单一菌的降解率提高10%左右，但仍不能达标排放。要使COD值继续降低，可对高效菌用目标废液进行定向逐步驯化，进一步提高高效菌的降解能力，最终达标排放。

表3 配伍菌100L罐的免蒸静止连续发酵实验结果Tab.3 Free autoclaved static continuous fermentation results of compatibility of high－efficient bacteria in 100Lfermentor

［1］刘义雄，张文宣，徐勇，等.利用微生物混合静止发酵降低赤霉素萃余液中COD含量［J］.农药，2013，52（9）：647－649.

［2］GB 11914－89，水质化学需氧量的测定——重铬酸盐法［S］.