红树林植物无瓣海桑内生真菌Neofusicoccum sp.SaBA3 次级代谢产物的研究

秦 淳，林秀萍，艾 文，钟志龙，冼嘉韵，徐石海，刘永宏*

1暨南大学化学系，广州 510632;2中国科学院南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室，广州 510301

红树林作为自然生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的一种特殊的木本植物群落，一直处于高盐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧污泥的特殊环境。内生真菌指生活在生物组织内部，不会引发生物组织产生明显病症的一类真菌［1］。植物内生真菌全部或部分生活周期都在植物体内，与植物形成互惠共生的关系。由于红树林生存环境独特，根据自然进化理论，可以推测红树植物及其内生真菌的次级代谢产物可能蕴含着生物活性多样、结构新颖的代谢产物［1］。近年来，世界各地的多个研究小组开展了对红树林内生真菌次级代谢产物的研究，已分离出一批结构新颖，具有细胞毒活性、抗菌、抗氧化，抗炎，保肝等生物活性的化合物［2-6］。

为了获得结构新颖、生物活性良好的化合物，作者对分离来自红树植物无瓣海桑Sonneratia apetala的一株内生真菌Neofusicoccum sp.SaBA3 进行了大米发酵。从其发酵产物中分离得到8个化合物，通过1D 和2D NMR 以及文献对照等手段鉴定了这些化合物的结构，化合物2-8 首次从Neofusicoccum 属中分离得到。

1 仪器与材料

NMR 谱用Bruker AV-500 核磁共振仪测定;质谱图采用API2000 型ESI 质谱仪测定;中压制备柱色谱为Buchi 公司产品(C615/605);葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(Pharmacia);薄层色谱硅胶、柱色谱硅胶和薄层制备板(20 × 20 × 0.03 cm)均购自青岛海洋化工厂，化学试剂均为国产分析纯。

海洋真菌Neofusicoccum sp.SaBA3 从红树植物无瓣海桑Sonneratia apetala 的树枝中分离得到，无瓣海桑Sonneratia apetala 与2010 年10 月采自广东省广州市南沙区红树林。采集后的红树植物装于干净容器中，避免挤压。放置于冰箱中，次日对其进行内生真菌的分离。

发酵培养基及条件:大米200 g，粗海盐2 g，自来水200 mL，装于1000 mL 三角瓶中，浸泡过夜，121 ℃灭菌20 分钟。将种子液接种到20 瓶大米培养基中，25 ℃恒温发酵一个月。

2 提取分离

固体发酵物用丙酮浸泡过夜，切成小块，充分搅拌后，超声提取10 min，抽滤，收集上清液。残渣再用乙酸乙酯浸提三次，每次充分搅拌后，超声提取10 分钟，抽滤，收集上清液。将四次得到的上清液合并，减压旋转蒸发，水浴控制温度低于60 ℃，得浸膏30.3 g。粗浸膏溶解后按1∶1 的比例与100-200的硅胶H 拌匀，干燥完全后用中低压正相硅胶柱分离，石油醚-丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脱，经TLC 薄层检测合并，得到15个馏分Frs.1-15。Frs.2 经SephadexLH-20 凝胶柱(氯仿-甲醇，1∶1)分离，得到6个馏分Frs.21-Frs.26，其中Frs.23 经硅胶柱分离，氯仿-丙酮(100∶1，50∶1，20∶1)梯度洗脱，TLC 检测合并，减压蒸馏得到化合物5(86 mg);Frs.3 经重结晶，得到化合物3(139 mg);Frs.4 经SephadexLH-20凝胶柱(氯仿-甲醇，1∶1)分离，得到3个馏分Frs.41-Frs.43，Frs.41 经硅胶柱分离，石油醚-氯仿(100∶0，50∶1，0∶100)梯度洗脱，TLC 检测合并，减压蒸馏得到化合物7(16 mg);Frs.6 经Sephadex LH-20 凝胶柱(氯仿-甲醇，1∶1)分离，得到4个馏分Frs.61-Frs.64，其中Frs.62 经正相硅胶柱分离，石油醚乙酸乙酯(100∶0，50∶1，20∶1，5∶1)梯度洗脱，TLC 检测合并，减压蒸馏得到化合物4(150 mg);Frs.9 经SephadexLH-20 凝胶柱(氯仿-甲醇，1∶1)分离，得到6个馏分Frs.91-Frs.96，其中Frs.95 经硅胶柱分离，氯仿-甲醇(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1)梯度洗脱，TLC 检测合并，经薄层制备板(氯仿-丙酮，2∶1)分离，得到化合物1 (1.6 mg);Frs.10 经Sephadex LH-20 凝胶柱(氯仿-甲醇，1 ∶1)分离，得到3个馏分Frs.101-Frs.103，其中Frs.102 经硅胶柱分离，氯仿-甲醇(100∶0，20∶1，10∶1，2∶1)梯度洗脱，TLC 检测合并，经薄层制备板(石油醚-丙酮，5∶1)分离，得到化合物2(1.9 mg);Frs.15 经SephadexLH-20 凝胶柱(甲醇)分离，得到4个馏分Frs.151-Frs.154，其中Frs.151 经硅胶柱分离，氯仿-丙酮(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1)，TLC 检测合并，经薄层制备板(石油醚-丙酮，10∶1)分离，得到化合物6 (3.1 mg);Frs.154 经硅胶柱分离，氯仿-甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，2∶1，0∶1)，经TLC 检测合并，得化合物8(10.2 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 白色固体，分子式为C13H16O5。ESIMS m/z 253［M+H］+，此化合物在紫外(甲醇)222和288 nm 处有最强吸收。13C NMR(DEPT)显示13个碳信号，两个甲基其中包括一个氧甲基，两个亚甲基，三个次甲基其中包括两个连氧的次甲基，六个季碳其中包括一个羰基，两个连氧的季碳。通过HSQC 把相应的氢原子和碳原子连接起来。1H-1HCOSY 显示H-C(2)/ H-C(3)/ H-C(4)相关，在结合HMBC 里面的H-C(2)跟C(1)，C(3)，C(4)相关可以得到片段1b(Fig.1)。通过H-C(4)跟C(4a)，C(5)，C(8a)相关就能够把1a，1b 这两个片段连接起来。该化合物3，4 位的相对立体构型是通过NOESY 确定的，NOESY 显示H-3 和H-4 不相关，说明H-3 和H-4 不在同一侧，是反式构型。以上数据和文献［7］报道基本一致，故确定该化合物为(3S*，4S*)-3，4-二氢-3，4，8-三羟基-7-乙基-6-甲氧基萘-1-酮。具体的NMR 数据归属如下:1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.85 (1H，s，H-5)，4.58 (1H，m，H-4)，4.03 (1H，m，H-3)，3.95 (3H，s，-OCH3)，3.03 (1H，dd，J=4.0，4.5 Hz，H-2)，2.68 (1H，m，H-2)，2.68 (2H，m，H-2')，1.08 (3H，t，J=7.5 Hz，H-1');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:202.3(C-1)，165.3 (C-6)，162.7 (C-8)，145.8 (C-4a)，119.3 (C-7)，111.3 (C-8a)，102.9 (C-5)，73.9 (C-4)，71.9 (C-3)，56.3 (-OCH3)，44.5 (C-2)，16.3(C-2')，13.5(C-1')。

图1 化合物1 的结构片段，部分重要的HMBC (H→C)，1H，1H-COSY (—)相关Fig.1 Sturcture fragments of 1，and selected HMBC (H→C)，1H，1H-COSY (—)correlations

化合物2 无色针状结晶(氯仿)，分子式为C12H12O4。ESI-MS m/z 221［M+H］+，此化合物在紫外(甲醇)308 nm 处有最强吸收。13C NMR (DEPT)显示12个碳信号，三个甲基其中包括两个氧甲基，三个次甲基(双键)，6个季碳其中包括三个连氧季碳和一个酯羰基。1H NMR 显示δH:6.66 (1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.61 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，这是苯环上间位的两个氢原子的相互耦合裂分的特征峰。通过HSQC 把相应的氢原子和碳原子连接起来。HMBC 显示CH3-C (7)跟C (10)，C (6)，C(7)相关，CH3O-(δH3.86)跟C (7)，CH3O-(δ:3.93)跟C (4)都有相关，就能够把三个甲基的相对位置给定下来。H-C (3)跟C (4)，C (10)相关，H-C (8)跟C (7)，C (9)，C (6)，C (10)相关，H-C (6)跟C (10)，C (8)，CH3-C (5)也有相关，这样把化合物2 的结构连接起来，如图Fig.2。以上数据和文献［8］报道基本一致，故鉴定为4，7-二甲氧基-5-甲基香豆素。具体NMR 数据归属如下:1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:6.66 (1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.61 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，5.53(1H，s，H-3)，3.93 (3H，s，-OCH3)，3.83 (3H，s，-OCH3)，2.61 (3H，s，-CH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:169.7 (C-4)，163.1 (C-2)，162.0 (C-7)，156.7 (C-9)，138.5 (C-5)，115.6 (C-6)，107.9(C-10)，98.8 (C-8)，87.6 (C-3)，55.9 (-OCH3)，55.5 (-OCH3)。

图2 化合物2 的结构，部分HMBC (H→C)相关Fig.2 Structure of 2，and selected HMBC (H→C)correlations

化合物3 白色针状结晶(甲醇)，分子式为C28H44O。254 nm 下有紫外吸收，碘熏显色，TLC 展开10%硫酸乙醇显红色斑点。1H NMR (500 MHz，CDCl3)显示有6个甲基1.03 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.94 (3H，s，H-19)，0.91 (3H，d，J=7.0 Hz，H-28)，0.83 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，0.80(3H，d，J=7.0 Hz，H-26)，0.63 (3H，s，H-18)，0.91 (3H，d，J=7.0 Hz，H-28)和3.36 (1H，m，H-3)连氧次甲基的信号，推测该化合物为甾醇类。δH5.56 (1H，brs，H-6)，5.38 (1H，brs，H-7)，为环上的双键，5.22 (1H，dd，J=15.3，7.0 Hz，H-22)，5.18(1H，dd，J=15.3，7.1 Hz，H-23)，为侧链上的反式双键。13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:38.4 (C-1)，32.0 (C-2)，70.5 (C-3)，40.8 (C-4)，139.8 (C-5)，119.6 (C-6)，116.3 (C-7)，141.3 (C-8)，46.3(C-9)，37.1 (C-10)，21.1 (C-11)，39.1 (C-12)，42.8 (C-13)，54.6 (C-14)，23.0 (C-15)，28.2 (C-16)，55.8 (C-17)，12.0 (C-18)，16.3 (C-19)，40.4(C-20)，21.1 (C-21)，135.6 (C-22)，132.0 (C-23)，42.8 (C-24)，33.1 (C-25)，19.8 (C-26)，19.6(C-27)，17.6 (C-28)。以上数据和文献［9］报道基本一致，故鉴定为麦角甾-5，7，22-三烯-3β-醇。

化合物4 无色针状结晶(甲醇)，分子式为C28H46O3。254 nm 下有紫外吸收，碘熏显色，TLC 展开10%硫酸乙醇显黑色斑点。1H NMR (500 MHz，CD3COCD3)显示C-3 位连氧次甲基质子信号δH:3.76 (1H，m)，C-3 位羟基δH3.68 (1H，brs)和6个甲基信号，分别为1.02 (3H，d，J=6.6 Hz)，0.93(3H，d，J=6.8 Hz)，0.89 (3H，s)，0.86 (3H，s)，0.85 (3H，d，J=7.2 Hz)，0.83 (3H，d，J=6.8 Hz)，初步推测为该化合物为一甾醇类化合物。1H NMR 中还显示两对邻位烯质子信号δH6.22 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.48 (1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，5.19 (1H dd，J=15.5，7.5 Hz，H-22)，5.25(1H，dd，J=15.5，7.5 Hz，H-23);13C NMR (125 MHz，CD3COCD3)δC:36.3 (C-1)，31.7 (C-2)，66.8(C-3)，38.4 (C-4)，83.0 (C-5)，137.0 (C-6)，131.7 (C-7)，80.0 (C-8)，53.1 (C-9)，38.6 (C-10)，24.6 (C-11)，40.9 (C-12)，45.8 (C-13)，53.3(C-14)，21.9 (C-15)，29.9 (C-16)，57.6 (C-17)，13.8 (C-18)，19.0 (C-19)，44.1 (C-20)，21.9 (C-21)，137.1 (C-22)，133.5 (C-23)，44.3 (C-24)，34.4 (C-25)，20.5 (C-26)，20.8 (C-27)，18.6 (C-28)。以上波谱数据与文献［10］对照基本一致，故鉴定为麦角甾-6，22-二烯-5α，8α-环二氧-3-醇。

化合物5 白色粉末状固体，分子式为C28H46O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)，δH5.70 (1H，s，H-4)，1.16 (3H，s)，0.89 (3H，d，J=5.5 Hz)，0.82(3H，d，J=8.0 Hz)，0.81 (3H，d，J=7.0 Hz)，0.78 (3H，d，J=7.0 Hz)，0.69 (3H，s);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δC:35.6 (C-1)，33.9 (C-2)，199.3 (C-3)，123.7 (C-4)，171.4 (C-5)，32.0 (C-6)，28.1 (C-7)，35.6 (C-8)，53.8 (C-9)，38.5 (C-10)，21.0 (C-11)，39.5 (C-12)，42.2 (C-13)，55.8(C-14)，22.6 (C-15)，26.1 (C-16)，56.0 (C-17)，11.9 (C-18)，17.3 (C-19)，35.7 (C-20)，19.7 (C-21)，32.8 (C-22)，24.1 (C-23)，45.8 (C-24)，29.1(C-25)，18.6 (C-26)，18.5 (C-27)，11.9 (C-28)。以上波谱数据与文献［11］对照基本一致，故鉴定为麦角甾醇-5-烯-3-酮。

化合物6 白色晶体(甲醇)，分子式为C28H48O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:0.66 (3H，s，18-CH3)，0.86 (6H，d，J=6.5 Hz)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，21-CH3)，1.05 (3H，d，J=6.5 Hz)，1.16(3H，s)，3.78 (1H，m，H-3)，5.23 (2H，m)。以上数据与文献［12］对照基本一致，与胆甾醇标准品进行TLC 展开对照，发现Rf 值及显色行为均一致，故鉴定为3β-羟基胆甾醇。

化合物7 无色油状物，分子式为C10H10O4。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:7.73 (1H，dd，J=5.5，3.0 Hz，H-3)，7.54 (1H，dd，J=5.5，3.5 Hz，H-4)，3.91 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:168.0 (C-1)，132.0 (C-2)，131.0 (C-3)，128.8 (C-4)，52.5 (-OCH3)。以上数据与文献［13］报道的数据基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二甲酯。

化合物8 白色固体，分子式为C4H4N2O2。ESI-MS m/z 113 ［M+H］+，1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)δH10.99 (1H，brs，3-NH)，10.82 (1H，brs，1-NH)，7.39 (1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，5.45(1H，d，J=7.5 Hz，H-6)。以上数据与文献［14］报道的数据基本一致，故鉴定为尿嘧啶。

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