儿童手足口病病例中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的调查分析

苏文锦

云南省临沧市人民医院 医学检验科，云南临沧 677000

2011年2月—2013年8月，我科诊断250例患手足口病者，在取得患儿家庭的同意之后，从250例患手足口病儿童中抽选出69例作为病原学分析对象，在69例病原学分析对象中，手足口病伴随脑炎的有3例。患手足口病儿童的病原学的调查分析状况，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年2月—2013年8月，我科从250例患手足口病儿童中抽选出69例作为病原学分析对象，调查分析患手足口病儿童的病原学。在初诊病例之中，250例患手足口病儿童，男性150例，女性100例，年龄：8 个月到13岁。在抽选的手足口病儿童69例分析病例之中，男性38例，女性31例，年龄：1～12岁，平均（7.05±2.50）岁，无论是初诊的250例患手足口病儿童病例，还是选出的手足口病儿童69例分析病例，在年龄构成、性别构成、病状构成上无显著差异，P＞0.05。病例标本均于患病7 d 中收集，其中，在3 d 中收集的有62例，在4～7 d 中收集的有7例。在收集的69例标本病例中，幼托机构病儿47例；手足口病病毒明确接触史35例；48例发病年龄为3～6岁。

1.2 调查方法

1.2.1 收集标本 经常规消毒清洁之后，将手足口病儿童所发疱疹之中的水疱液体进行收集，与此同时，经消毒灭菌棉签收集儿童深部咽拭子，并收集5 克手足口病儿童粪便，随后，将所收集标本保存并冷藏于-40℃处[1]。

1.2.2 分离病毒 将所收集的水疱液标本悬液进行Vero 细胞、RD细胞接种，与此同时，对粪便标本悬液以及咽拭子标本悬液也予以Vero 细胞、RD 细胞接种，随后，将接种后的粪便标本、咽拭子标本以及水疱液标本培养于36℃到37℃处。此外，每代观察时长为1 周（7d），2 代观察时长共为2 周（14d），当CPE(细胞病变)为“++++”之时予以收获，并将之置放并保存于-20℃处.

1.2.3 血清学鉴定（病毒分离株）首先，经EV 组合血清鉴定病毒分离株，随后，通过EV71 以及CA16 单价血清对病毒分离株之中未能定型的予以鉴定。

1.2.4 鉴定PT-PCR（病毒分离株）对于病毒分离株之中用血清学不能定型的要通过RT-PCR 进行定型，随后合成为CA16型的特异性引物（含VP1 因子）与EV71型的特异性引物（含VP1 因子）。其中，EV71型的特异性引物（上下游引物）能够将DNA 片段（332bp）予以扩增。CA16型的特异性引物（上下游引物）能够将DNA 片段（221bp）予以扩增。

1.2.5 试管分析 随后，通过QIamp Viral RNA Mini kit（德国所产，Qiagen）将病毒之中含有的RNA 予以提取。随后，将Reardy-to-GO RT-PCR Bead（瑞典，1 粒）以及1μL 上下游引物、43μl 的DEPC 水、2μl 的酶抑制剂（RNA）、1μl 的病毒RNA 加入每支PCR试管之中，整体反应体积为50μl。在PCR 试管之中所做反应有：10min72℃；60s72℃，30s 55℃，30s 95℃，35 个 循 环；3min94℃，45min42℃。随后，将PCR 产物放置于琼脂糖凝胶（3%）经电泳之后予以分析。与此同时，并抽出病毒9 株送往疾病预防控制中心鉴定分析VP1 区之中的核苷酸序列[2-3]。

1.3 统计方法

统计分析检验：t 检验，用标准差以及均数表示计量资料，计数资料统计：χ2检验。统计软件：SPSS 16.0[4]。

2 结果

2.1 病毒分离结果

在抽选的手足口病儿童69例分析病例之中，一共收集标本100 份，其中，有粪便标本30 份，咽拭子标本35 分，疱疹液标本35 份。对这些标本行病毒分离。分离结果显示，从标本病例之中分离出病毒的有65例，因此检出病毒概率：94.20%。在100 份检出标本之中，分离出病毒的有89 份，包括：疱疹液标本30 份，咽拭子标本29 份，粪便标本30 份，病毒分离阳性概率：89.00%，且标本与标本间分离的病毒阳性率无显著差异，P＞0.05。

2.2 血清学鉴定结果

EV 组合血清能够将埃可病毒1～7 以及33 病毒、30 病毒、29病毒、27 病毒、25 病毒、20～22 病毒、11～14 病毒、柯萨奇B、CA9、脊髓灰质炎病毒予以鉴定，所鉴定出病毒的89例检测标本通过EV组合血清行中和试验病毒定型，未发现上述血清型别病毒，于是再经EV71 以及CA16 单价血清予以中和试验，鉴定结果为阴性。

2.3 鉴定RT-PCR 结果

因为经血清学方法无法将分离病毒型别鉴定出来，所以经RT-PCR 予以鉴定。在分离出病毒的89 份试验标本之中，经RTPCR（2 对引物）对病毒扩增VP1 段，结果都出现PCR 产物，且CA16 引物表现出211bp 段扩增，详见图1。EV71 引物表现出322bp 段扩增，详见图。

2.4 鉴定结果

55例77 份检出标本显示病毒分离株类型：CA16，10例12 份检出标本显示病毒分离株类型：EV71。此外，抽出9 株送往疾病预防中国控制中心鉴定的病毒（CA167 株、EV712 株）测定序列和RT-PCR 测定一致。

图1 CA16 引物的PCR 产物电泳

图2 EV71 引物的PCR 产物电泳

2.5 临床资料

比较55例77 份检出标本显示病毒分离株类型：CA16，10例12 份检出标本显示病毒分离株类型：EV71 的病例资料，无显著差异，P＞0.05。具体见表1。

表1 病毒分离株类型病例临床资料对比

3 讨论

本文旨在调查分析患手足口病儿童的病原学，从标本病例之中分离出病毒的有65例，因此检出病毒概率：94.20%。在100 份检出标本之中，分离出病毒的有89 份，病毒分离阳性概率：89.00%。经EV71 以及CA16 单价血清予以中和试验，鉴定结果为阴性。经RT-PCR 予以鉴定。因为经血清学方法无法将分离病毒型别鉴定出来，所以经RT-PCR 予以鉴定。在分离出病毒的89 份试验标本之中，经RT-PCR（2 对引物）对病毒扩增VP1 段，结果都出现PCR 产物，且CA16 引物表现出211bp 段扩增。EV71 引物表现出322bp 段扩增。55例77 份检出标本显示病毒分离株类型：CA16，10例12 份检出标本显示病毒分离株类型：EV71。可见手足口病儿童病原主要为：EV71、CA16，因此应当对EV71、CA16加强预防[5]。

[1]张建华，江炳福，程险峰，等.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1 基因特征分析[J].东南大学学报（医学版），2013，19(12)：173-179，200-201.

[2]曾昭森.荧光RT—PCR 同步检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A 组16型方法的建立及应用[J].临床和实验医学杂志，2012，11(16)：1327-1328.

[3]李国英，李润青，张晓慧，等.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A 组致手足口病临床特点分析[J].中国全科医学（学术研究文集），2012，15(11)：1271-1272.

[4]魏贯峰，周素华，胡强.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型抗体筛查在手足口病中的应用及相关性[J].中国医师进修杂志，2012，35(16)：20-22.

[5]姚瑶，赵秀英，何菡，李润青，等.手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A 组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析[J].中华检验医学杂志，2011，34(18)：695-699.