慢性淋巴细胞性白血病患者miR-9 -3 甲基化异常及其意义

周 毅 任国敏 杨聪慧 任春霞 孟庆鹏

DNA 甲基化是指通过化学修饰在DNA 甲基转移酶的作用下，以S -腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基(-CH3)基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核昔酸胞嘧啶的5＇位碳原子上，导致5 -甲基胞嘧啶的形成［1］。肿瘤抑制基因CpG 岛相关启动子的基因特异性DNA 甲基化是众多人类肿瘤标志物［2-3］。多个肿瘤抑制基因的甲基化涉及白血病，淋巴瘤和骨髓瘤的信号通路的失调，由此表明肿瘤抑制基因的甲基化在血液癌症发病机制中的重要性［4-6］。值得注意的是，肿瘤抑制基因DNA 甲基化在慢性淋巴细胞性白血病的发病或预后中发挥作用［7］。慢性淋巴细胞白血病是欧美成人最常见的白血病类型，我国较少见，为主要源于B 淋巴细胞的单克隆性小淋巴细胞疾病［8］。在本实验中，采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术研究了miR -9 -3 的甲基化，旨在确定其在慢性淋巴细胞性白血病的致病作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

慢性淋巴细胞性白血病共78 例，均来自内蒙古牙克石市人民医院。男51 例(65.4%)，女27 例(34.6%)，年龄37～91 岁，平均年龄65.0 岁，经诊断符合白血病FAB 国际诊断标准。所有病例均为新诊断且未接受过放化疗、诱导分化及骨髓移植等特殊治疗。采集肝素抗凝骨髓1 ～2 ml/份，收集骨髓单个核细胞，于-80℃保存。8 例正常供髓者单个核细胞设为对照组(取自健康志愿者外周血B 细胞CD19，N =3;取自健康志愿者外周血血浆，N =2;取自健康志愿者骨髓单个核细胞，N=3)。

1.2 细胞株培养

人类白血病细胞株CLL-AAT、MEC1、MEC2、I83 -E95、WAC3CD5 +、HG3 和232B4 由内蒙古牙克石市人民医院血液病科赠送。细胞分别保存在含有10%胎牛血清的RPMll640 营养培养基(含青霉素100 U/ml 和链霉素100 ug/ml)，置于320%O2、5%CO2、37℃培养箱培养的细胞培养箱培养。每48 ～72 h 用含有0.02%EDTA、0.01%胰蛋白酶的消化液消化后，进行常规传代培养。实验采用对数生长期细胞。

1.3 甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)

按照QIAampDNAMini Kit(QIAGEN，Germany)的操作步骤结合DNA/RNA 提取仪(QIAcube)输入程序即可快速抽提78 例慢性淋巴细胞性白血病患者骨髓标本和7 种慢性淋巴细胞性白血病细胞株DNA，同样方法提取8 例正常对照提取DNA。每个样品用两组引物，其中一个针对修饰的甲基化DNA(M)，另一个是针对修饰的未甲基化DNA(U)。重亚硫酸氢盐处理:加入新鲜配制的20 mmol /L 氢醌12.6 ul 和4.8 mol/L 亚硫酸氢钠(pH =5.0)320 ul，PCR 仪上进行下面循环:55 ℃15 min，95 ℃30 s，一共20 个循环。以EZ DNA Methylation kit 对基因组DNA 进行修饰。修饰后的DNA 溶解于20 ul 的M-Elution Buffer，反应产物在20g/L 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。

1.4 MSP 测序

首先应用亚硫酸钠对DNA 进行化学修饰，并用作模板，MSP 检测miR -9 -3 基因启动子区DNA 序列。将DNA 中所有未甲基化的胞嘧啶(C)转化成为胸嘧啶(T)，但有甲基化修饰的C 经亚硫酸钠处理后仍保持为C。该步骤应用EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN，Germany)，按照说明书完成。使用PSQ 检测设计软件设计引物。正向引物:5＇ -GAAGGGGGTTGGGATTTGA -3＇;反向引物:5＇ - ATTTCTCCCCTACTCCCC-3＇。

1.5 5 -氮杂-2＇ -脱氧胞苷(5 -AzaDc)处理

取细胞在对数生长期的I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株，按照1 ×106个细胞/ml 的密度接种于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养液，5%CO2、37℃的条件下培养。用终浓度为0.5 uM 的5 -AzaDc 处理，每24 h 更换新鲜的5 -AzadC，在第0 天和第5 天分别收获细胞。

1.6 Western blot 检测NF-κB1

I83 -E9548 细胞株转染48 h 后收集细胞。加入RIPA裂解液(50 mM 的Tris -HCl，pH =7.4，150 mM 氯化钠，0.2%SDS，1%TritonX-100，2 mM EDTA)，Bradford 法测定蛋白浓度，取20 ug 蛋白，进行10%SDS -PAGE 电泳。电泳完毕后，PAGE 胶上的蛋白用Bio -Rad 微型电转移至0.2 um 的硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜加入NF -κB1，4℃下孵育24 h，然后将膜洗涤，加入抗兔辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，室温下反应1 h 洗膜，曝光，X -胶片经显影、定影后扫描记录。以Anti-actin 为内对照。

2 结果

2.1 慢性淋巴细胞性白血病miR-9 -3 的MSP 结果

78 例慢性淋巴细胞性白血病患者中65 例miR-9 -3 甲基化，MSP 阳性率为83%(见图1);所有8 例正常对照组(N1至N8)miR-9 -3 全部呈未甲基化状态(见图2);7 种慢性淋巴细胞性白血病细胞株miR -9 -3 甲基化表达谱显示:I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株显示miR -9 -3 完全甲基化，232B4，CLL-AAT 和HG3 部分甲基化，而MEC1 和MEC2完全未甲基化(见图3)。miR -9 -3MSP 产物序列分析显示，与miR-9 -3 原序列相比，除了甲基化的C 外，所有的C均被转化为T，而CpG 位点中被甲基化的C 未被转化。说明我们的转化方案不仅是高效的，也是特异的(见图4)。

图1 慢性淋巴细胞性白血病患者的miR-9 -3MSP 结果

图2 对照组的miR-9 -3MSP 结果

2.2 5 -AzaDc 对miR-9 -3 甲基化程度的影响

结果表明，处理前I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株miR-9 -3 呈甲基化状态，而用5 -AzaDc 处理后，I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株miR-9 -3 呈未甲基化状态。

图3 慢性淋巴细胞性白血病细胞株的miR-9 -3MSP 结果

2.3 转染miR-9 -3 对I83 -E9548 细胞株NF -κB1 蛋白水平的影响

I83-E9548 细胞株转染48h 后收集细胞，提取细泡的蛋白，采用用Western blot 法来比较各组细胞内NF -κB1 蛋白P105 和P50 的含量。转染miR -9 - 3 后NF - κB1 蛋白P105/50 表达水平降低。如图6 所示，miR -9 -3 组与对照组相比NF-κB1 蛋白水平降低。

图4 miR-9 -3 基因启动子区DNA 序列MSP 测序结果

图5 5 -AzadC 对I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株治疗作用

图6 I83 -E9548 细胞株NF-κB1 蛋白水平的变化

3 讨论

成熟的microRNA(miRNA)是一类长度约21 -25nt 的真核生物内源性非编码单链RNA 分子，它在细胞内通过碱基互补与相应的信使RNA(mRNA)的3’- 非编码区(3’-URT)结合，使其降解或抑制其翻译，在细胞的分化、增生、凋亡、个体发育及机体代谢中起着重要作用［9］，其功能是抑制其靶蛋白的表达［10］。在癌变过程中，miRNA 可分为致癌基因和抑癌基因的miRNA［9］。最近研究表明，癌症患者抑癌基因的miRNA 异常DNA 甲基化沉默。以往的研究还确定一些抑癌基因的miRNA 甲基化参与慢性淋巴细胞性白血病发病，其中包括了miR -203，miR -124 -1，miR -181a/b，miR-107 和miR-424［10］。

在人类中，有三个独立的miR-9 基因(miR -9 -1 位于1 号染色体上;miR-9 -2 位于5 号染色体上;miR -9 -3 也位于5 号染色体上)具有相同的miR -9 序列。miR -9 即可以是致癌基因的miRNA 也可以是抑癌基因的miRNA，取决于癌症或组织类型［11］。例如，miR -9 过表达已被证明能提高乳腺癌细胞或胶质母细胞瘤转移或侵袭，表现为致癌作用，反之，miR-9 通过结合于3＇非翻译区(3＇非编码区)的NF-κB1 的mRNA，抑制NFκB1 翻译卵巢肿瘤细胞，从而抑制细胞增殖，因此表现出肿瘤抑制功能。本实验主要研究miR-9 独立基因之一miR-9 -3 的甲基化。

本实验发现，在I83 -E95 细胞株miR -9 -3 完全甲基化导致细胞增殖减少并且增强凋亡。

I83 -E95 和WAC3CD5 +细胞株处理前二者均呈高甲基化状态，而5 -AzadC 处理后都发生脱甲基化，呈未甲基化状态。这些都说明5 -AzaDc 具有诱导miR-9 -3 去甲基化的能力，这种能力可能与5 -AzaD 降低了miR -9 -3 表达有关。有人认为5 -AzaDc 作用机制是先与靶基因结合，再与DNA 甲基转移酶结合，形成一个不可逆的复合体，从而阻断甲基转移酶的活性。

有研究表明［12］，miR-9 -3 可以通过调控NF -κB1 蛋白抑制慢性淋巴细胞性白血病细胞的生长，miR -9 -3 在慢性淋巴细胞性白血病细胞中是低表达的，而增加miR -9 -3可以抑制细胞的体外生长，另外miR -9 -3 直接作用于NF-κB1 的3’UTR 区，说明NF -κB1 是慢性淋巴细胞性白血病中miR-9 -3 的重要的靶点，当miR -9 -3 高表达时NF-κB1 的mRNA 和蛋白都被抑制。在慢性淋巴细胞性白血病中是否也存在这种相关，本实验设想通过减弱或抑制miR-9 -3 的表达，观察其对慢性淋巴细胞性白血病细胞NF -κB1 的表达，为下一步慢性淋巴细胞性白血病的基因治疗奠定实验基础。

［1］ ESTELLER M. Epigenetics in cancer［J］. N Engl J Med，2008，358:1148 -1159.

［2］ CHIM CS，LIANG R，KWONG YL.Hypermethylation of gene promoters in hematological neoplasia［J］. Hematol Oncol，2002，20:167 -176.

［3］ JONES PA，BAYLIN SB:The epigenomics of cancer［J］. Cell，2007，128:683 -692.

［4］ GONZALEZ-ZULUETA M，BENDER CM，YANG AS，NGUYEN TD，et al. Methylation of the 5＇ CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing［J］. Cancer Res，1995，55:4531 -4535.

［5］ CHIM CS，PANG R，FUNG TK，CHOI CL，LIANG R.Epigenetic dysregulation of Wnt signaling pathway in multiple myeloma［J］. Leukemia，2007，21:2527 -2536.

［6］ CHIM CS，FUNG TK，WONG KF，LAU J，LIANG R:Frequent DAP kinase but not p14 or Apaf -1 hypermethylation in B -cell chronic lymphocytic leukemia［J］.J Hum Genet，2006，51:832 -838.

［7］ RAVAL A，TANNER SM，BYRD JC，ANGERMAN EB，et al.Downregulation of Death-Associated Protein Kinase 1 (DAPK1)in Chronic Lymphocytic Leukemia［J］. Cell，2007，129:879 -890.

［8］ 姚玉芹，薛重重，杨丽萍. CD40 -CD40L 与B 细胞肿瘤治疗研究进展［J］.现代医院，2013，13(5):17 -19.

［9］ 黄秀颜，徐 新. miRNA 与心律失常［J］. 现代医院，2013，13(9):11 -131.

［10］ CALIN GA，CROCE CM. MicroRNA signatures in human cancers［J］. Nat Rev Cancer，2006，6:857 -866.

［11］ CHEN CZ. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.N Engl J Med，2005，353:1768 -1771.

［12］ WANG LQ，LIANG R，CHIM CS. Methylation of tumor suppressor microRNAs:lessons from lymphoid malignancies［J］. Expert Rev Mol Diagn，2012，12:755 -765.

［13］ TSAI KW，LIAO YL，WU CW，HU LY，LI SC，CHAN WC，et al. Aberrant hypermethylation of miR -9 genes in gastric cancer［J］.Epigenetics，2011，6:1189 -1197.

［14］ ZHANG H，QI M，LI S，QI T，MEI H，et al.microRNA-9 targets matrix metalloproteinase 14 to inhibit invasion，metastasis，and angiogenesis of neuroblastoma cells［J］. Mol Cancer Ther，2012，11:1454 -1466.