不同条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响

摘 要：本文研究了不同菌龄、预处理时间、酶解时间、酶浓度等对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响，确定了有利制备率与再生率提高的最佳条件。

关键词：产黄青霉菌 原生质体制备 原生质体再生

中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（a）-0123-01

原生质体融合能将遗传特性不同的两亲本原生质体融合杂交，筛选后获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子[1]。当前使用最广泛的就是以PEG为融合剂的化学法，具有经济、方便、可重复性强等优点[2]。产黄青霉菌是原生质体融合的常用菌种，原生质体制备是融合的前提。本文探讨了在菌龄、预处理时间、酶解时间、酶浓度等不同水平下，同时有利于制备率与再生率提高的综合条件，为提高产黄青霉菌与其他菌的融合提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 产黄青霉菌

1.1.2 试剂

（1）缓冲液（CPB）：0.2 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲溶液中。按文献[4]配制。

（2）高渗缓冲液：以CPB配制的0.8 mol /L山梨醇。

（3）酶液：以CPB配制。（4）预处理剂：0.05 mol/L EDTA-Na2溶液+0.2%β-巯基乙醇，以CPB配制。

1.1.3 培养基

（1）液体完全培养基（YEPD）：参照文献[3]。（2）再生培养基（YEPDS）：参照文献[3]。

以上均以0.73×105Pa灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 原生质体制备

参照文献[4]。

1.2.2 原生质体再生

参照文献[4]。

1.2.3 影响原生质体制备率与再生率的单因素试验

（1）菌龄：14 h，16 h，18 h，20 h。（2）预处理时间：10 min，20 min，30 min。

（3）酶解时间：15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min。（4）酶浓度：0.5%，1.0%，2.0%，4.0%。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响

2.1.1 菌龄对制备率与再生率的影响 本试验研究了同时接种后培养12 h、14 h、16、18 h菌龄的菌体相对应的制备率依次为94.8%、91.1%、83.4%、71.7%，再生率依次为2.5%、3.0%、3.3%、3.9%。试验结果可见，再生率随着菌龄延长，产黄青霉原生质体的制备率逐渐降低，而再生率则逐渐升高。

2.1.2 预处理时间对制备率与再生率的影响

预处理时间10 min、20 min、30 min对应的制备率依次为80.3%、88.1%、91.9%，再生率依次为4.2%、3.6%、1.9%。试验结果可见，预处理对原生质体的制备有促进作用，制备率随预处理时间延长而升高；但是对细胞壁的再生起副作用，再生率随时间延长而下降。

2.1.3 酶解时间对制备率与再生率的影响

酶解时间15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min对应的制备率依次为55.1%、85.1%、89.3%、91.0%、93.2%、95.2%，再生率依次为4.2%、3.3%、2.3%、1.1%、0.9%、0.6%，试验结果可见在120 min内，原生质体形成率与酶作用时间成正比递增，120 min左右细胞基本原生质体化，但是再生率在15 min时最高，随时间延长而降低。

2.1.4 酶浓度对制备率与再生率的影响

对0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的酶浓度对制备率与再生率进行试验，对应的制备率依次为63.25%、73.58%、88.57%、90.68%，再生率为4.15%、3.55%、3.23%、1.60%。结果可见，随着酶浓度的增加原生质体的制备率升高，再生率降低。

2.2 优化条件下的产黄青霉原生质体制备率与再生率

综合以上试验结果可以得出如下结论：菌龄16 h，以2.0%蜗牛酶进行酶解，酶解温度30℃，酶解时间30 min，0.8 mol/L山梨醇做渗透压稳定剂，以0.05 mol/L EDTA-Na2溶液和0.2%β-巯基乙醇为预处理剂处理20min为产黄青霉原生质体制备率和再生率均较高的最佳条件。在此优化条件下，原生质体形成率为85.1%，再生率为3.8%。

3 讨论

3.1 制备率

菌体的原生质体制备主要是细胞的去壁，菌龄与细胞壁密切相关。对数生长期的菌体细胞壁较薄，对酶更加敏感；稳定期细胞壁厚，不利于酶解，制备率反而会随菌龄的延长而降低。

去除细胞壁是对菌体的一种破坏，破坏时间越长原生质体生成量越多。EDTA-Na2能产破坏黄青霉菌细胞壁外层，也利于蜗牛酶渗入内层促进细胞壁的降解和避免影响酶活；β-巯基乙醇可破环细胞壁碳骨架中的二硫键，促进扩散进入内壁层，因而预处理时间越长原生质体制备率越高。因此，在本试验所选择的酶解时间和酶浓度范围内原生质体的制备率与二者呈正相关。

3.2 再生率

菌体的菌龄越长，细胞壁强度越高，失去细胞壁后更利于壁的再生，所以随着菌龄的延长再生率也升高。

菌体被破坏的越严重其细胞壁的再生也就越困难。β-巯基乙醇对细胞本身也具有毒性，所以预处理时间越长原生质体再生率也就越低。由于蜗牛酶是混合酶，混有蛋白酶和核酸酶等对原生质体有损伤作用的酶类，故不宜长时间或高浓度的将原生质体暴露其中。目前已有文献表明，在膜外有残余细胞壁组分时会更有利于壁的再生。因此，选择合适的酶浓度及酶解时间以减少对菌体的破坏而有利于对原生质体的再生是有利的。

参考文献

[1] 罗立，潘力，郑穗平.细胞工程[M].广州：华南理工大学出版社，2003：5-19.

[2] 王娟娟，贾彦军.微生物原生质体融合方法的综述[J].畜牧兽医科技信息，2005，10：17-19.

[3] 文铁桥，赵学慧.克鲁维酵母与酿酒酵母属间原生质体融合构建高温酵母菌株[J].菌物系统，1999，18（1）：89-93.

[4] 龚建根，刘颐屏.产黄青霉菌和顶头孢霉菌原生质体形成、再生和属间融合[J].中国医药工业杂志，1991（5）.