慢性心衰大鼠下丘脑室旁核谷氨酸脱羧酶对交感神经活动的影响

王仁俊，温美玲，寇正涌，李 华，郝锡联，赵 卓，周 革，周晓馥

多种心血管疾病（冠心病、高血压等）的终末阶段都表现为慢性心力衰竭，是严重危害人类健康的心脏疾病。虽然临床上用β受体抑制剂、肾素-血管紧张素醛固酮系统阻滞剂等对此有一定的治疗作用，但其确诊后四年病死率仍高达50%，目前仍缺乏有效的治疗手段。

研究显示，慢性心衰的重要病理特征是交感传出神经兴奋性增强[1]。导致心衰状态下交感神经兴奋性增强的主要原因可能与中枢作用机制改变有关[2-5]。但是，慢性心衰情况下下丘脑室旁核（PVN）内神经递质参与交感神经兴奋亢进的确切机制仍不十分清楚。众所周知，下丘脑室旁核是调节交感紧张性的重要神经核团，许多神经递质参与PVN部位的调节作用。目前认为抑制性反应主要是由γ-氨基丁酸（GABA）参与完成，而合成GABA的限速酶由分子量为67kDa的谷氨酸脱羧酶（GAD67）和分子量为65kDa的谷氨酸脱羧酶（GAD65）两种亚型存在[6-7]，其中GAD67在GABA合成中发挥主要作用[8]。另有研究报道显示心衰状态下下丘脑室旁核GABA合成量明显下降[9-10]，研究结果提示心衰状态下下丘脑室旁核谷氨酸脱羧酶表达量发生改变。这种下丘脑室旁核合成γ-氨基丁酸限速酶表达的失衡及其功能的衰减与心衰状态下交感神经兴奋亢进密切相关，而慢性心衰大鼠PVN由谷氨酸脱羧酶参与的交感神经抑制作用是否发生改变，其内在机制如何尚未见相关报道，有必要进行深入研究，以探寻防治慢性心力衰竭的新策略和新方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重180～200g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.2 药品试剂与实验设备

烯丙基甘氨酸、乌拉坦、α-氯醛糖、滂胺天蓝购于Sigma-Aldrich公司；肝钠素购于北京鼎国生物技术公司；多道生理记录仪、大鼠脑立体定位仪、微操纵器等。

1.3 构建慢性心衰大鼠模型

慢性心衰大鼠模型由结扎大鼠冠状动脉左旋降支方法诱导，首先采用乙醚吸入法麻醉大鼠，然后将其在手术台上仰位固定，自左侧4～5肋间用弯头止血钳撑开胸廓，剪开心包膜暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左旋降支，以带线缝合针快速穿线结扎冠状动脉左旋降支，结扎后，见心脏缺血区颜色变化后，将心脏迅速恢复于胸腔中，并排出胸腔内积液和气体，立即关闭胸腔，开胸后结扎冠脉步骤在30秒内完成。假手术组只穿线，不结扎冠脉。结扎术后邻近的前3天，肌肉内注射青霉素，结扎术后第6～8周对假手术大鼠与心衰大鼠进行数据检测。

1.4 实验分组：

动物随机分为两大组：假手术组（n=8）和心衰组（n=8），每组动物分别在下丘脑室旁核微量注射不同剂量谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸。

1.5 血流动力学指标观察及肾交感神经放电活动记录

大鼠采用α-氯醛糖（70mg·kg-1）和乌拉坦（0.75g·kg-1）腹腔注射麻醉，分离右侧颈总动脉，并用PE50管插管，另一端通过压力换能器连于多道生理记录仪上，同步采集血流动力学各项指标，首先记录左心室舒张末期压（LVEDP），后将PE50导管退出左心室，连续记录动脉血压及标Ⅱ导联心电图，同步算出心率。肾交感神经的分离及其放电活动的记录方法详细步骤参见文献[4-5]。

1.6 下丘脑室旁核核团定位及微量注射

大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，并参照Paxions&Waston大鼠脑图谱[11]，在下丘脑PVN（前囱后1.8 mm，L和R 0.4 mm，H=7.8mm）微量注射200纳升（nl）相同体积的溶剂（Vehicle）人工脑脊液（pH=7.4），并先后分别微量注射200nl不同剂量的谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸，从每次注射完成后开始计时，连续观察心率、血压和肾交感神经放电对微量注射药物或人工脑脊液的反应，每次给药时间间隔30min。微注射实验完毕，用过量麻醉剂将动物处死。将体积为50 nl、浓度为2%的滂胺天蓝溶液缓慢注入下丘脑PVN。剪断大鼠头颅，去除颅骨，在4%多聚甲醛溶液中固定脑组织，3天后作冰冻切片（厚度为30μm），中性红染色，在体视显微镜下观察药物是否进入下丘脑室旁核，定位偏离PVN者不列入统计。

1.7 检测大鼠左心室心肌梗死面积

急性动物实验结束后迅速将大鼠心脏从胸腔中取出，并转移至-20℃冰箱中保存。心肌梗死面积检测的具体方法与参考文献报道一致[12]。

1.8 大鼠PVN组织取材

用过量麻醉剂将假手术组和心衰组大鼠处死，取脑并迅速转移至干冰上冰冻。用冰冻切片机在PVN核团所在位置连续切6张100μm厚的脑片，用12号针头在脑片上PVN核团所在位置双侧总共打12个孔。针头内的组织即为PVN核团组织。

1.9 Western bolt检测

取假手术组和心衰组大鼠PVN内脑组织分别加入蛋白提取缓冲液（10 mMTris，1mMEDTA，1%SDS，0.1%Triton X-100和1 mMPMSF），超声粉碎，37℃孵育30 min；4℃13000×g离心2min；上清液即为全细胞蛋白，Bradford法测定蛋白浓度；各组等量蛋白样品经SDS-PAGE分离后，三明治法电转移至硝酸纤维素膜；封闭液（含5%脱脂奶粉TBST）室温封闭；分别用一抗谷氨酸脱羧酶GAD65和GAD67抗体（1∶500，rabbit polyclonal），GAPDH（1∶1000），室温和4℃孵育过夜后，膜用TBST洗涤干净。然后用1∶4000稀释的红外荧光标记二抗（Alexa Fluor 800或Alexa Fluor 700）分别对膜避光孵育1小时，Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白进行检测。

1.10 统计分析

2 结果

2.1 心衰组与假手术组大鼠血流动力学等各项生理学指标检测结果

对大鼠整体及其离体器官进行检测发现，与假手术组相比，心衰组大鼠心脏重量、体重和肺湿重显著增加（P<0.05），结果提示心衰大鼠有水潴留以及肺淤血迹象。其次，心衰组大鼠左心室心肌梗死面积较假手术组明显增加（P<0.05），心衰组大鼠左心室心肌梗死面积在30%～40%之间，而假手术组大鼠左心室心肌未发生梗死。对大鼠血液动力学指标检测，结果发现与假手术组相比，心衰组大鼠左心室最大收缩舒张速率（±dp/dt）明显下降；而心衰组大鼠左室舒张末期压（LVEDP）却显著升高（P<0.05）（表1）；以上结果表明心衰大鼠心脏功能显著下降，该表现类似于临床慢性心衰症状。

表1 比较心衰组与假手术组大鼠血流动力学等各项生理学指标

2.2 注射谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸

与溶剂对照组相比，假手术组和心衰组大鼠PVN内微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸导致心率、血压和肾交感神经放电呈剂量依赖性升高（P<0.05），但与假手术组相比，心衰组心率、血压和肾交感神经放电升高幅度显著减小（P<0.05）（图1、图2和图3）。心率、血压和肾交感神经放电对烯丙基甘氨酸开始反应的时间是2～3min，微量注射烯丙基甘氨酸4.5～5.5 min内各项指标的峰值出现，而在室旁核微量注射烯丙基甘氨酸20～25min内，各项指标恢复至给药前基线水平，并且心衰组大鼠心率、血压和肾交感神经放电的恢复时间为22.3±1.6 min，与假手术组恢复时间23.1±1.8min无显著差异（P>0.05）。

图1 下丘脑室旁核微量注射烯丙基甘氨酸对心率的影响

图2 下丘脑室旁核微量注射烯丙基甘氨酸对血压的影响

图3 下丘脑室旁核微量注射烯丙基甘氨酸对肾交感神经放电活动的影响

2.3 检测大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶GAD65和GAD67蛋白表达量

因为谷氨酸脱羧酶分为谷氨酸脱羧酶GAD65和GAD67两种亚型，故分别在6只假手术组和6只心衰组大鼠中，使用Western bolt技术检测假手术组、心衰组大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶GAD65和GAD67亚型蛋白表达量。研究结果显示与假手术组相比，心衰组大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶GAD65亚型蛋白表达量未发生显著改变（P>0.05）（图4），然而心衰组大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶GAD67亚型蛋白表达量显著下调（P<0.05）（图5）。

图4 假手术组与心衰组大鼠下丘脑室旁核谷氨酸脱羧酶GAD65亚型蛋白表达量

图5 假手术组与心衰组大鼠下丘脑室旁核谷氨酸脱羧酶GAD67亚型蛋白表达量

3 讨论

本项研究工作证实心衰大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶参与的交感紧张性调节作用减弱。在大鼠PVN微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸，引起心率加快、血压升高和肾交感神经放电增加，这可能是与微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂烯丙基甘氨酸后，交感神经的传出活动的去抑制有关。值得注意的是与假手术组比，心衰组PVN微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂后心率、血压和肾交感神经放电升高幅度显著降低，结果提示心衰大鼠PVN的谷氨酸脱羧酶参与的紧张抑制作用发生钝化。这种PVN的谷氨酸脱羧酶参与的交感缩血管紧张抑制作用的功能减弱可能是心衰的交感神经兴奋性增强作用机制之一。

然而，心衰大鼠PVN内谷氨酸脱羧酶功能衰减的明确机制还不十分清楚。为进一步揭示其内在作用机制，Western blot结果提示心衰大鼠PVN的谷氨酸脱羧酶参与的紧张性抑制作用发生钝化，与谷氨酸脱羧酶67亚型的表达量下调有关，该结果与康玉明等人的报道相一致[10]。此外，仍存在下述几种导致心衰大鼠室旁核谷氨酸脱羧酶功能衰减的可能机制：（1）突触前γ-氨基丁酸合成或释放的减少以及γ-氨基丁酸降解的增加与谷氨酸脱羧酶功能改变密切相关，从而导致交感神经兴奋亢进。（2）大鼠室旁核内谷氨酸脱羧酶磷酸化和去磷酸化水平的改变。（3）大鼠室旁核内不同种类激素或神经递质合成水平的失衡。

大鼠神经核团立体定位切片鉴定结果提示，室旁核内微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂导致肾交感神经放电、血压和心率的增加为室旁核内特异性反应，即注射时的酸碱化学刺激或机械刺激不能影响肾交感神经放电、血压和心率的变化，因为在室旁核内微量注射pH为7.4的相同体积溶剂人工脑脊液，肾交感神经放电、血压和心率均未见显著改变。进一步于室旁核邻近部位微量注射相同PH值和体积的谷氨酸脱羧酶抑制剂，肾交感神经放电、血压和心率亦未发生明显变化，结果提示室旁核内微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂引起的特异性反应并非由药物扩散到室旁核邻近部位所引发；此外，静脉注射2.5倍于室旁核微量注射最高剂量的谷氨酸脱羧酶抑制剂未导致肾交感神经放电、血压和心率发生明显变化，结果提示室旁核内微量注射谷氨酸脱羧酶抑制剂引起的特异性反应与药物进入血液循环作用于其它外周组织器官无关。

综上所述，本研究显示慢性心衰状态下PVN内谷氨酸脱羧酶参与的交感传出抑制作用发生钝化与谷氨酸脱羧酶的表达量下调有关，结果提示PVN内谷氨酸脱羧酶功能的减弱和谷氨酸脱羧酶的表达量下调是心衰状态下心血管功能异常（如交感兴奋性增强等）的重要病理机制之一。

[1]Cohn JN,Levine TB,Olivari MT,et al.Plasma Norepinephrine Asa Guide to Prognosisin Patients With Chronic Congestive Heart Failure[J].NEngl JMed,1984,311：819-823.

[2]Zhang K, Li YF, Patel KP.Reduced endogenous GABA mediated inhibition in the PVN on renal nerve discharge in rats with heartfailure[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2002, 282（4）：1006-1015.

[3]Ren Jun Wang, Qing Hua Zeng, Wei Zhong Wang, et al.GABAA and GABAB receptor-mediated inhibition of sympathetic outflow in the paraventricular nucleus is blunted in chronic heart failure[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2009,36（5）：516-522.

[4]王仁俊,寇正涌.运动训练改善心衰大鼠室旁核GABAA受体介导的交感传出抑制作用[J].东北师大学报：自然科学版,2009,41（3）：107-113.

[5]王仁俊,韩俊杰.运动训练改善心衰大鼠室旁核GABAB介导的交感传出抑制作用[J].吉林师范大学学报：自然科学版,2009,30（1）：65-68.

[6]Erlander MG, Tillakaratne NJ, Feldblum S, et al.Two genes encode distinct glutamate decarboxylases [J].Neuron, 1991, 7（1）：91-100.

[7]Bu DF, Erlander MG, Hitz BC, et al.Two human glutamate decarboxylases, 65-kDa GAD and 67-kDa GAD, are each encoded by a single gene [J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89（6）：2115-2119.

[8]Soghomonian JJ, Martin DL.Two isoforms of glutamate decarboxylase：why[J]Trends Pharmacol Sci, 1998, 19（12）：500-505.

[9]Han TH, Lee K, Park JB, et al.Reduction in synaptic GABA release contributes to target-selective elevation of PVN neuronal activity in rats with myocardial infarction [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010, 299（1）：129-139.

[10]Yu Ming Kang, Rong Li He, Li Min Yang, et al.Brain tumour necrosis factorα modulates neurotransmitters in hypothalamic paraventricular nucleus in heart failure[J].Cardiovascular Research, 2009, 83（4）：737-746.

[11]Paxions G,Watson C.Therat brain in stereotoxic coordinates[M].New York：Academic Press,1986.

[12]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1994：921-922.