实脾饮对糖尿病肾病大鼠的保护作用*

孙红旭，马鸿斌，薛国忠，崔庆荣

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医学院附属医院，甘肃 兰州 730020；3.甘肃省中医药管理局，甘肃 兰州 730000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重也是最常见的慢性并发症之一，它引发的终末期肾功能衰竭正在成为威胁糖尿病患者生命的主要原因。中医药在辅助西药治疗该病方面有一定的特色和优势。实脾饮出自《济生方》，由附子、干姜、茯苓、白术、木瓜、厚朴、木香、大腹子、草果、甘草、生姜、大枣组成，具有温阳健脾、行气利水等功效。本研究选用高糖高脂饲料合并STZ注射，再予以腺嘌呤加寒凉药的方法建立大鼠 DN 脾肾阳虚型动物模型，观察其药效特点。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SD大鼠(SPF级)70只，体质量200～240 g,由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXF(甘)2011-0021。

1.2 药品、试剂与仪器

实脾饮，药材来源于甘肃中医学院附属医院。贝那普利片，上海新亚药业闵行有限公司产品,批号H20044840。链尿佐菌素(STZ)，购自美国Sigma公司，批号100K20090523, 临用前用预先高压灭菌的0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液 (pH值 4.4) 配成10 g/L的溶液。腺嘌呤,上海新兴化工试剂研究所提供，批号061188；内皮素(ET)放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所提供，批号110820；一氧化氮(NO)试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号20111111；转换生长因子β1(TGF-β1)测定试剂盒，上海史瑞克生物科技有限公司提供，批号20110812。GC-911r放射免疫计数器及KDC-2044低速冷冻离心机，均为科大创新股份有限公司中佳分公司产品；UV-2401PC分光光度仪，日本岛津产品；B60-32FB3-F01型显微镜，日本奥林巴斯公司产品；XYJ-80-2型电动离心机，金坛市恒丰仪器厂产品；TG328B型光学读数分析天平，湘仪天平仪器厂生产；日立7170全自动生化仪，日本HITACH产品；血糖检测仪，德国拜耳公司产品。

1.3 糖尿病肾病模型的建立

将70只大鼠按体质量编号,以随机数字表法抽取10只为空白对照组,全程用基础饲料喂养(总热量15.335 J/g,碳水化合物热卡占53%,脂肪热卡占9%,蛋白质热卡占20%)；其余60只均以高糖高脂饲料(脂肪 41% ，蛋白 17% ，碳水化合物 42%)喂养4周。第5周将60只大鼠禁食12 h后，按 30 μg/g的剂量腹腔内注射STZ柠檬酸溶液1次，3 d后再同剂量注射1次。末次注射STZ 1周后,用腺嘌呤350 mg/(kg·d)加苦寒中药煎剂(龙胆草、栀子、番泻叶)4 mL/(kg·d)混合灌服,连续2周。测血糖、尿糖及尿量。造模大鼠若血糖值高于16.7 mmol/L、尿糖在++以上(含++)、尿量增加多于1倍，出现蛋白尿，大鼠表现出阳虚症状者提示造模成功[1-3]。

1.4 分组与给药

取造模成功大鼠50只，随机分为模型对照组、贝那普利组[4]及实脾饮高、中、低剂量组共5组，每组10只。各组分别灌胃相应的药物，大鼠与人之间药物剂量的换算按照文献[3]所载公式计算。实脾饮高、中、低剂量组按10 μL/g灌胃实脾饮混悬液，剂量分别为15，7.5，3.75 g/(kg· d)，相当于人用药量的 10，5，2.5倍；贝那普利组灌胃悬液1×10-3g/kg，模型对照组及空白对照组按10 g/kg 灌胃蒸馏水。共给药8周。

1.5 检测指标与方法

①造模后观察大鼠一般状态[3]。②于给药前及给药后8周检测空腹血糖。③给药后第8周末,检测并记录体质量，处死前一天收集24 h尿液；脱臼处死所有大鼠，股动脉采血，以3500 r/min离心10 min,分离血清,于-25 ℃冰箱内保存以检测SCr、ET、NO、TGF-β1含量；迅速取出双侧肾脏，盐水洗涤，称量其湿质量。其中大鼠肾脏湿质量用光学读数分析天平称量；24 h尿蛋白定量、FBG、SCr用日立7170全自动生化仪测定；ET采用放射免疫法测定，NO采用硝酸还原酶法测定，均按试剂盒说明书进行；血清TGF-β1含量用酶联免疫吸附法测定，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

模型对照组大鼠明显消瘦，多饮、多尿，精神萎靡，倦怠，蜷缩，反应迟钝，动作迟缓，毛发无光泽。贝那普利组亦有类似表现，但程度较轻。实脾饮高、中剂量组大鼠体质量增加，精神状态良好，反应灵敏，动作自如，毛发光泽。实脾饮低剂量组大鼠精神状况、反应、毛色较高、中剂量组差，但较模型对照组和贝那普利组好。

2.2 各组大鼠体质量、肾指数对比

与模型对照组对比，实脾饮高、中剂量组大鼠体质量明显增加, 肾指数均降低, 差别均有统计学意义(P<0.05)；贝那普利组及实脾饮低剂量组的大鼠体质量和肾脏指数均无明显改善(P>0.05)。与贝那普利组对比，实脾饮高、中剂量组肾脏指数降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量、肾指数对比 ±s

2.3 各组大鼠FBG对比

与模型对照组对比，实脾饮高、中、低剂量组大鼠FBG下降，差别有统计学意义(P<0.05)；贝那普利组FBG较之差别无统计学意义(P>0.05)。说明贝那普利无明显降糖效果，见表2。

表2 各组大鼠FBG对比

2.4 各组大鼠SCr对比

与模型对照组对比，实脾饮高、中剂量组大鼠SCr下降，差别有统计学意义(P<0.05)；贝那普利组和实脾饮低剂量组无明显改善，差别无统计学意义(P>0.05)。说明贝那普利和实脾饮低剂量降低SCr的作用不明显，见表3。

表3 各组大鼠SCr对比

2.5 各组大鼠24 h尿蛋白定量对比

与模型对照组对比，实脾饮高、中剂量组和贝那普利组大鼠24 h尿蛋白量下降，差别有统计学意义(P<0.05);实脾饮低剂量组无明显改善，差别无统计学意义(P>0.05)。说明实脾饮高、中剂量及贝那普利均有降低大鼠尿蛋白的作用，而实脾饮低剂量降低大鼠尿蛋白作用不明显。实脾饮高剂量组24 h尿蛋白量与贝那普利组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，说明实脾饮高剂量的疗效较佳；实脾饮中剂量组较之，差别无统计学意义(P>0.05)，说明二者疗效相当。见表4。

注：与空白对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05；与贝那普利组对比，△ P<0.05。

2.6 各组大鼠血清NO、ET对比

与模型对照组对比，各治疗组NO升高、ET降低，差别有统计学意义(P<0.05)，说明各药物均有升高大鼠NO、降低ET的功效。实脾饮高、中剂量组NO、ET与贝那普利组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，说明实脾饮高、中剂量较贝那普利疗效显著；实脾饮低剂量组与贝那普利组对比，差别无统计学意义(P>0.05)，说明二者疗效相当；实脾饮高剂量组与中剂量组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，说明实脾饮高剂量疗效较佳。见表5。

注：与空白对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05；与贝那普利组对比，△ P<0.05；与高剂量组对比，＊ P<0.05。

2.7 各组大鼠血清TGF-β1对比

模型对照组大鼠血清TGF-β1含量与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。各治疗组与模型对照组对比，大鼠血清TGF-β1含量在实脾饮高、中剂量组均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，说明治疗均有效；实脾饮高剂量组大鼠血清TGF-β1与贝那普利组对比，差别有统计学意义(P<0.01)，提示贝那普利和实脾饮均能降低大鼠血清TGF-β1含量；实脾饮高剂量组降低大鼠血清TGF-β1含量效果更明显。见表7。

注：与空白对照组对比，** P<0.01；与模型对照组对比，# P<0.05，## P<0.01；与贝那普利组对比，△△ P<0.01。

3 讨 论

3.1 选方依据

糖尿病肾病属中医学“消渴”范畴。一般认为该病初起多为阴虚燥热，日久发展为糖尿病肾病，此过程中脾肾阳虚多起着决定性作用，为其基本病机[5]。《太平圣惠方》中提到：“三消者，本起肾虚或食肥美之所发也。腰肾冷者阳气以衰……故成病矣。”明确指出了消渴病是由于肾虚及饮食不节而引起，肾阳气虚衰，不能上助脾阳，故而发为本病。实脾饮出自《济生方》，以附子、干姜为君，附子温肾阳而助气化，干姜温脾阳而助运化，二药相合，温肾健脾，温补脾肾之阳；臣以茯苓、白术渗湿健脾，使水湿从小便而去；佐以木瓜除湿醒脾和中，厚朴、木香、大腹子、草果行气导滞，气化则湿化，气顺则胀消，且草果、厚朴兼可燥湿，大腹子兼能利水，甘草、生姜、大枣益脾和中，生姜兼温散水气之功，甘草尚能调和诸药，同为佐使。诸药相伍，脾肾同治，而以温脾阳为主；寓行气于温利之中，令气行则湿化。临床疗效亦表明，实脾饮为符合糖尿病肾病病机、治法的有效组方。

3.2 模型评价

高糖高脂饲料加STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型为目前普遍采用的造模方法之一。本实验为了模仿该病中医病理特点，在此基础上选用腺嘌呤加寒凉药的方法。造模大鼠出现摄食减少，形体消瘦，身体蜷缩，体毛无光泽，反应迟钝，精神萎靡，体质量下降，血糖升高，大量蛋白尿，肾功能损害等，提示造模成功。

3.3 指标特点

肾小球滤过率(GFR)的检测一般是要根据其他物质水平的测定来确定，被测物质分为外源性和内源性。其中外源性的测定24 h尿蛋白定量可以准确的评估出GFR水平[6]。内源性物质中，SCr是一种相对较理想的指标，能够直接、灵敏的反映GFR的程度，特异性较高[7-8]。实验表明：体内NO和ET应处于一种动态平衡的状态，以保证血流动力学的稳定。糖尿病肾病初期NO升高，使肾脏入球小动脉扩张，导致肾小球系膜舒张，损伤。接着，ET代偿性分泌增多，水平逐渐上升，NO水平逐渐下降，进一步加剧了肾小球硬化的过程[9]。TGF-β1能够促进细胞增殖、ECM形成和组织纤维化的作用，TGF-β1在DN中介导肾脏纤维化发展的过程[10]。

3.4 结论与展望

本课题研究结果显示:实脾饮能改善 DN 大鼠的一般状况，增加体质量，降低肾指数，降低FBG、SCr、24 h尿蛋白定量、ET、TGF-β1含量，升高大鼠血清NO含量，进而减轻肾组织的病理损害，延缓肾小球硬化和肾小管间质纤维化进程，对 DN 有很好的保护作用。但在实脾饮中发挥作用的有效成分及其作用靶点与机制仍不清楚，且并未证明实脾饮高剂量是否是最优剂量，故日后应向方药作用基础研究方面努力，包括实脾饮的作用机制、药理研究、量效关系、配伍效应及药代动力学等方面的研究。

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