芽孢杆菌活体微生物农药研究现状及应用

王 春，汪 琨，崔志峰

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310014)

农业生产每年都会因病虫害而造成巨大损失。长期以来人们一直主要采用化学农药控制农作物病虫害，但化学农药的3R问题 (残留、再增猖獗、抗性)已引起越来越多的关注。目前在生物农药中，微生物活体农药已占有举足轻重的地位，特别是现代微生物技术等新的研究开发手段应用于微生物农药领域，大大促进了活体微生物农药的开发。

芽孢杆菌不仅能产生抗菌物质，且具有抗逆性、耐高温、易贮存等生物学特性，分布广泛，对人畜无毒无害，不污染环境，是一种理想的生防微生物［1］。近年来，芽孢杆菌的生态、生理和防病作用以及在农业领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。

1 芽孢杆菌杀虫剂

全世界已有30多个国家的100多家公司共生产出150多个品种的细菌杀虫剂［2］，制成产品并广泛应用的主要有苏云金芽孢杆菌 (B．thuringiensist)、日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌4种［3］，其中苏云金芽孢杆菌是当今研究最多的杀虫细菌，其制剂被用来防治150多种害虫 (主要是鳞翅目害虫)。

1.1 苏云金芽孢杆菌

苏云金芽孢杆菌是一种广泛存在的产芽孢的革兰氏阳性菌，主要有库斯塔克、日本、拟步甲和以色列4个亚种。在孢子形成过程中，产生伴孢晶体、朊蛋白和晶体包含体。苏云金芽孢杆菌的杀虫活性成分主要是其在生长过程中产生的不同类型的杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)。目前，已经找出了数十种生物杀虫活性成分，胞外因子有酶类:几丁质酶，磷脂酶C，溶血素，VIP杀虫蛋白;醇类:双效菌素;核苷类:苏云金素。胞内因子有蛋白质:杀虫晶体蛋白，免疫抑制因子A，肠毒素;芽孢:活芽孢［4］。除了产生内毒素，许多苏云金芽孢杆菌本身对昆虫来说也是很强的致病菌。已经分离得到苏云金芽孢杆菌许多与ICP有关的基因，经过修剪并将其导入作物中，使作物本身也具有杀虫能力。例如孟山都公司将苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种的cry1A(c)基因转入棉花和番茄中［5］。

苏云金芽孢杆菌菌系的研究主要在2个方面，一是寻找自然存在的苏云金芽孢杆菌新菌系;二是利用分子生物学技术将已确定的苏云金芽孢杆菌菌系进行改造，研发杀虫活性更高、防治谱更广的生防菌［6］。利用分子生物学技术对筛选的苏云金芽孢杆菌菌株进行质粒转移，拓宽杀虫谱。例如Crickmore等［7］将具鞘翅目活性的cry3A基因导入以色列亚种后，重组菌株不仅增加了对鞘翅目昆虫的毒性，还产生对鳞翅目大菜粉蝶的毒性。通过改造ICP基因结构，提高毒蛋白活性。美国Sandoz公司通过改变苏云金芽孢杆菌的wuhanensis亚种的毒蛋白氨基酸组成，使杀虫毒性提高了2～3倍。在构建苏云金芽孢杆菌基因工程菌时，增加ICP基因拷贝数可以提高ICP基因表达量。利用辅助蛋白的增效作用，也可以增加ICP晶体蛋白的表达量。Wu等［8］最早注意到27 Ku蛋白能提高65 Ku及130 Ku蛋白杀蚊毒力。Adams等［9］研究也表明，存在于cry4D操纵子中的20 Ku蛋白能显著增加cryA在大肠杆菌中的表达量。另外还可通过增加ICP基因拷贝数和对启动子结构改造来提高ICP晶体蛋白的表达量，提高杀虫能力。

1.2 球形芽孢杆菌

球形芽孢杆菌是一种严格需氧微生物，其杀虫谱比苏云金芽孢杆菌窄，一般仅对蚊虫有毒性。在球形芽孢杆菌中发现有2类不同的杀虫毒素，一类是二元毒素 (Bin毒素)，另一类是杀蚊毒素 (Mtx毒素)［10］。由于球形芽孢杆菌的芽孢和晶体在环境中持效期长，并有可能在环境中再循环，适用于防治污水中的淡色库蚊和致倦库蚊，因此，对球形芽孢杆菌高毒菌株的筛选受到广泛重视［11］。迄今，美国、法国和中国等多个国家研制了其液剂、乳剂和粉剂等10余种产品。到目前为止，中国每年生产球形芽孢杆菌实验制剂在150 t左右，每年应用面积2 000 hm2以上，已成为世界上球形芽孢杆菌生产量最大、应用最广、应用效果最佳的国家。2001年，中国第一个利用球形芽孢杆菌C3-41研制的杀蚊商品制剂 (康宝)已获批准生产和应用［12］。

对球形芽孢杆菌的研究主要利用分子生物学技术来提高持效期、扩大杀蚊普。山东省寄生虫病防治研究所构建了一株基因工程藻类，把含有球形芽孢杆菌蛋白基因穿梭质粒转入鱼腥藻 (pDc26)中，当工程藻细胞的浓度在6.0×105个·mL-1以上时，48 h可杀死99%～100%蚊幼虫。连续观察2个多月，该基因工程藻仍有明显的杀蚊效果，比单独使用球形芽孢杆菌效果更好［13］。

1.3 日本金龟子芽孢杆菌

金龟子芽孢杆菌主要通过芽孢感染和传播，在幼虫消化道内萌发成杆状营养细胞，营养细胞通过吞噬作用进入中肠细胞。金龟子芽孢杆菌在普通培养基上很难生长，在特殊培养基上虽可进行营养生长，但产芽孢仍然受到限制;在离体情况下，即使产生芽孢，这种芽孢毒力也比幼虫体内产生的芽孢毒力大大降低。缓死芽孢杆菌的培养条件比金龟子芽孢杆菌的更加苛刻，均为专性寄生菌，在自然界发病率较高，具有潜在的应用价值。目前日本金龟子芽孢杆菌孢子粉只能通过活体金龟子幼虫进行繁殖［14］。目前，仅有2家美国公司生产和出售日本金龟子芽孢杆菌制剂，分别是Fairfax生物实验室生产的制剂Doom和Japidemic，Rruter实验室生产的制剂 Milk-Spore［13］。

1.4 其他杀虫芽孢杆菌

青虫菌和杀螟杆菌都是好气性蜡状芽孢杆菌。青虫菌属低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒作用，而对蜜蜂和昆虫天敌无害，能够对蔬菜、水稻等害虫进行有效防治。杀螟杆菌是从中国感病稻螟虫尸体内分离得到的，主要防治水稻、玉米、蔬菜、茶叶等作物的鳞翅目害虫。另外，日本研制的森田芽孢杆菌制剂Labillus，主要用于卫生害虫的防治，将其拌入鸡饲料中，可抑制96%～99%的家蝇成虫羽化［15］。徐婉学等［16］报道了侧孢芽孢杆菌 AS1.864菌株对三带喙库蚊、尖音库蚊、白纹伊蚊等具有杀虫活性。还有一些昆虫病原芽孢杆菌，如蜡状芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌等。另缩短梭菌和天幕虫梭菌通过昆虫体培养制备的菌剂可用于一些毒蛾类幼虫的防治。

2 芽孢杆菌杀菌剂

芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物种群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，许多性状优良的天然分离株已成功地应用于植物病害的生物防治。芽孢杆菌可防治棉花枯萎病、小麦全蚀病、稻瘟病、叶枯病、黄瓜苗期猝倒病、马铃薯疮痂病、蔬菜苗期立枯丝核菌、菠菜枯萎病、小麦赤霉病、苹果红癌病、小麦根腐病、苹果轮纹病等多种植物病害［17］。目前芽孢杆菌活体杀菌剂商品不多［18-19］(表1-2)，但发展潜力巨大，主要集中在芽孢杆菌对植物病害防治上的应用。

2.1 枯草芽孢杆菌

美国已有 GB03、MB1600、QST713和 FZB244株枯草芽孢杆菌生防菌获得环保局商品化生产应用许可［20］。澳大利亚开发的B．subtilis A-13对麦类和胡萝卜的立枯病以及其他土传病害具有很好的防效，并对作物有一定的增产作用［21］。日本东京技术研究所的 B．subtilis RB14和 B.subtilis NB22分别对Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效［22］。

中国已开发出一批生物防治作用优良的枯草芽孢杆菌菌株 (如 B916，B908，B3，B903，BL03，XM16)、蜡样芽孢杆菌 R2、短小芽孢杆菌(Bacillus pumillus)A3和增产菌系列。江苏农科院植保所开发的B.subtilis B916已进行农药登记，对水稻纹枯病田间防效持续10年稳定在50%～80%［23］;南京农业大学分离的B.subtilis B3，商品名为麦丰宁，对小麦纹枯病田间防效达50%～80%;刘颖等［24］分离的B.subtilis TG-26和林福星等［25］分离的 Bacillus spp.Xh222、B.subtilis B034对不同的病原菌有强烈的抑制作用;林东等［26］分离的枯草芽孢杆菌S-0113对Trichothecium roseum、Fusarium spp.等抑制效果达到100%;辛玉成等［27］分离得到的枯草芽孢杆菌CN620菌剂对Glomerellaso、Alernaria、Trichothercium、Roserm、Pesutalotia spp．5种板栗烂果病的抑制作用均达到100%;李宏科等［28］研究发现，生防菌 BS-98能强烈抑制Physalaspora prioicola、芦苇枯萎病菌等植物致病菌。

表1 芽孢杆菌活体杀菌剂主要产品

2.2 其他杀菌芽孢杆菌

崔云龙等［29］研究表明，短小芽孢杆菌D82对小麦根腐病有强抗生作用;王静等［30］报道，短小芽孢杆菌AR03菌体和发酵液对烟草黑胫病菌具有拮抗活性，AR03对烟草黑胫病菌和青枯病具有可持续控病作用;连玲丽等［31］报道，短小芽孢杆菌EN16可以诱导番茄对细菌性青枯病的抗性;纪兆林等［32-33］试验研究发现，地衣芽孢杆菌W10、多粘类芽孢杆菌W3和多粘类芽孢杆菌Y2对苹果轮纹病菌、柑橘炭疽病菌和柑橘青霉病菌有明显的抑制作用，其中W10菌株的抑制最强，不仅抑制病菌菌丝生长，破坏菌丝细胞，还能抑制病菌分生孢子的产生和芽管的伸长。

果实离体试验表明，地衣芽孢杆菌W10可延迟果实腐烂，降低果腐率，抑制病斑扩展。因此，地衣芽孢杆菌W10在水果采后病害的防治上具有较大的应用潜力。彭化贤等［34］从水稻根部分离筛选得到一株地衣芽孢杆菌，其对稻瘟病菌具有较强的抑制作用，通过连续2年的田间防效病果测试，防效均在50%以上。Sid Ahemd［35］通过试验发现，地衣芽孢杆菌可增强角素抑制辣椒根腐病的活性。可见，地衣芽孢杆菌除了对一些植物致病菌有拮抗活性外，还对某些药剂具有一定增效作用。

赵德立等［36］报道，多粘芽孢杆菌JW-725对柑橘青霉具有很强的抑制作用;王笑颖等［37］筛选得到一株对大丽轮枝菌具有较强拮抗活性的多粘芽孢杆菌7-4，对棉花黄萎病具有良好的防效。由此可见，多粘芽孢杆菌在生物防治方面也具有重要的研究价值。另外，像蜡质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌等也有报道表明具有良好的生物防效。刘贯锋［38］对芽孢杆菌分类学和生防功能菌的筛选研究表明，共有11株芽孢杆菌对青枯雷氏尔菌有拮抗作用;对大肠杆菌有拮抗作用的菌株也为11株;另筛选出对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的芽孢杆菌16株。因此，芽孢杆菌生物防治具有巨大的研究和应用价值。

表2 美国EPA已登记注册的芽孢杆菌

3 小结与展望

随着一些化学农药逐渐被禁止使用和生产，微生物农药逐渐占据应用市场，芽孢杆菌作为活体农药防治植物病虫害的巨大潜能正日益受到人们的高度关注。与传统农药相比，生物农药的风险较低。美国是生物农药登记最多的国家，美国环保局(EPA)公布了已登记注册的芽孢杆菌数达到28种［39-40］，占总的生物农药的8.78%，未来这一比重将逐渐增大。

芽孢杆菌作为杀虫剂已经取得了一定的成功，但目前所占市场份额不足1%，主要是由于存在一些不足之处，例如杀虫谱窄，不能对在作物内部取食的害虫起作用;环境因素的影响，持效期短;易受其他微生物的作用而失效等。不过这也为改进活体杀虫剂起到了指示作用。

生物防治植物病害，芽孢杆菌无疑是研究和应用最多的。目前，芽孢杆菌拮抗基因的分离克隆、表达调控和遗传改良等研究已在国内外引起了高度的重视，芽孢杆菌作为活体农药展示了美好的前景。现在对活体农药的研究范围还不是十分广泛，迫切需要拓展新的研究方向。随着现代遗传工程技术的发展和环保观念的深入人心，芽孢杆菌作为活体农药将逐步替代传统化学农药。

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