苯酚硫酸法与蒽酮硫酸法测定铁皮石斛中多糖含量的比较

范传颍，陶正明，，吴志刚

(1.温州医学院，浙江温州 325035;2.浙江省亚热带作物研究所，浙江温州 325005)

铁皮石斛 (Dendrobium officinale)是我国传统名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效，常用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症［1］。铁皮石斛含有多糖、生物碱、萜类、挥发油、氨基酸、微量元素等多种化学成分。现代药理研究证明［2-4］，多糖具有增强免疫和抗肿瘤作用，铁皮石斛多糖含量较高，而被认为是其药用的主要有效成分。

多糖含量测定的方法有很多。一类是利用多糖的还原性，如3，5-二硝基水杨酸盐比色法和Somogyi-Nelson法;另一类是普遍使用的利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定，如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法。本文在已有的研究基础上［5］，对苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测定多糖含量进行了比较，为确定合理的铁皮石斛多糖含量测定方法提供依据。

1 材料与仪器试剂

铁皮石斛由浙江雁荡千山铁皮石斛种植基地提供。

岛津-2550型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司);Milli-Q A10型纯水仪 (美国Millipore公司);Mettler Toledo AL204型电子天平 (瑞士);KQ500型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);DZF-6050型真空干燥箱 (上海恒一科学仪器有限公司);HH-2型数显恒温水浴锅 (金坛市江南仪器厂)。

石油醚 (60～90℃)、乙醇、苯酚、浓硫酸、蒽酮均为分析纯，葡萄糖标准品 (分析纯，用前105℃烘2 h)。

2 方法与结果

2.1 铁皮石斛多糖的提取与精制

称取铁皮石斛粉末25.0 g，置圆底烧瓶中，加入石油醚150 mL，回流提取1 h(去脂)，过滤，挥干溶媒。滤渣用80%乙醇150 mL回流提取1 h，过滤，挥干溶媒。滤渣用200，150，150 mL蒸馏水依次回流提取，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩至150 mL，与等体积 sevag试剂 (正丁醇∶氯仿为4∶1)萃取多次，取上清液，缓慢加入乙醇，使溶液含乙醇80%，在滴加过程中用磁力搅拌器搅拌，静置过夜。过滤，沉淀用无水乙醇、丙酮清洗多次。沉淀置60℃真空干燥箱干燥，得铁皮石斛精制多糖，封装备用。

2.2 样品制备及试剂配制

样品制备。铁皮石斛茎干燥后粉碎，取0.25 g粉末置圆底烧瓶中，加入石油醚50 mL，脱脂30 min，趁热过滤，挥干溶媒。滤渣用80%乙醇回流提取1 h，趁热过滤，滤渣用80%乙醇充分洗涤，再次挥干溶媒。残渣用50 mL蒸馏水回流提1 h，过滤，再用35 mL蒸馏水回流提1 h，过滤，用少许热水洗涤药渣和烧瓶，合并滤液，冷却后在100 mL容量瓶中定容，得样品溶液。

对照品溶液的制备。精密称取无水葡萄糖100 mg加蒸馏水定容至100 mL，摇匀，得1 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液。

5%苯酚溶液的制备。精密称取5 g苯酚，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后，放置在棕色瓶中。

蒽酮硫酸溶液的制备。精密称取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，摇匀，放置于棕色瓶中。

2.3 标准曲线的制备及换算因子

2.3.1 苯酚-硫酸法标准曲线

分别精密量取1 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置100 mL容量瓶中，各加蒸馏水至刻度。精密量取上述各浓度的标准液2.0 mL于10 mL具塞试管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再精密加浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置5 min，置90℃水浴中加热15 min，取出，室温放置冷却，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在490 nm的波长处测定吸光度，得到回归方程y=0.061 1x-0.024 1，相关系数R2=0.999 1。表明葡萄糖浓度在2.5～15.0 μg·mL-1范围与吸光度有良好的线性关系。

图1 苯酚-硫酸法标准曲线

2.3.2 蒽酮-硫酸法标准曲线

分别精密吸取1 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL 置 100 mL 容量瓶中，各加蒸馏水至刻度。精密量取上述各浓度的标准液2.0 mL于10 mL具塞试管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0 mL，置水浴加热15 min，取出，放入冷水中冷却15 min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，测定625 nm处吸光度。得到回归方程y=0.010 9x+0.082 1，相关系数R2=0.999 0。表明葡萄糖浓度在5～30 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

图2 蒽酮-硫酸法标准曲线

2.3.3 换算因子

精密称取60℃干燥至恒重的铁皮石斛多糖10 mg，配制成0.04 mg·mL-1溶液。取2.0 mL按苯酚-硫酸法标准曲线的制备方法，测定吸收度，从回归方程中求得供试液中葡萄糖的质量，按F=W/C计算换算因子。式中:W为实际多糖质量，C为测得的多糖溶液中葡萄糖的质量。计算结果为F=1.249。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度

取供试液按上述方法操作，连续测定6次，相对标准差0.46%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性

取供试液分别按照苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法标准曲线项下的操作，测定反应结束后0，20，40，60，90，120 min时的吸光值。结果苯酚-硫酸法测得相对标准差为2.30%，蒽酮-硫酸法测得相对标准差为1.28%。

2.4.3 重现性

为考察方法的重现性，取同批次铁皮石斛6份，按照2.2节方法制备，分别用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测定其稳定性，结果测得两法的相对标准差分别为2.88%和2.52%。

2.4.4 回收率

分别称取已知含量铁皮石斛粉末各0.25 g，分别精密加入葡萄糖标准液适量，按样品制备和含量测定方法进行测定，计算加样回收率 (表1)，考察方法的准确度。

表1 加样回收率

2.5 样品的含量测定

9批铁皮石斛 (60℃烘干后，粉碎备用)分别取0.25 g，按照2.2节方法制备样品溶液。取1 mL样品溶液置10 mL容量瓶中定至刻度，再从10 mL容量瓶中取1 mL至10 mL试管中，加水至2 mL，按照两法各自标准曲线项下操作，由回归方程计算出葡萄糖的质量浓度 (表2)。

多糖的质量分数=(CS·D·V·F)/W。

式中:CS为供试品溶液中葡萄糖的质量浓度;D为供试品溶液的稀释倍数;F为多糖的换算因数;V为供试品溶液的体积;W为样品质量。

对表中数据进行统计学处理，方差齐性检验结果P＞0.1，无统计学意义，尚不能认为两者的方差不等，因此可采用方差相等的配对t检验。检验结果t=2.019，查t表得P＜0.05，有统计学意义，可以认为两种方法测定铁皮石斛多糖含量的结果不同，蒽酮-硫酸法测定结果偏高。

表2 样品的含量测定

3 小结与讨论

从方法学考察结果看，两种测定方法均有精密度、重复性、稳定性良好及操作简单等特点，理论上均具有可行性。

苯酚-硫酸法测定时需注意两点:一是苯酚易氧化，要用重蒸酚;二是反应过程剧烈，应避免不必要的伤害。蒽酮-硫酸法测定时，蒽酮硫酸需现用现配，相比苯酚硫酸法，反应过程较温和。

苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单、灵敏度高，试验时基本不受蛋白质存在的影响。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的多糖含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮-硫酸法测定结果偏高于苯酚-硫酸法。两种方法相比，苯酚-硫酸法测定更为合理准确，因此可作为铁皮石斛多糖测定的首选方法。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版1部［S］.北京:化学工业出版社，2010:266.

［2］ 罗慧玲，蔡体育，陈巧伦，等.石斛多糖增强脐带血和肿瘤病人外周血LAK细胞体外杀伤作用的研究［J］.癌症，2000，19(12):1124-1126.

［3］ 张红玉，戴关海，马翠，等.铁皮石斛多糖对S180肉瘤小鼠免疫调节功能的影响 ［J］.浙江中医杂志，2009，44(5):380.

［4］ 李钦，陈爱君，张信岳.铁皮石斛颗粒增强免疫功能作用研究 ［J］.中药药理与临床，2008，24(1):53.

［5］ 刘晓涵，陈永刚，林励，等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定枸杞子中多糖含量的比较 ［J］.食品科技，2009，34(9):270-272.