真空气流细胞破壁技术对桑叶中有效成分提取的影响

孙长波，石磊岭，涂建飞，韩丹丹，张清清，张 晶,*

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学发展学院，吉林 长春 130600；3.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)

桑叶为桑科(Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的干燥叶子，药用历史悠久，具有广泛的药理活性，是中医清热解毒之要药，用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头疼、目赤晕花等症[1]。桑叶中多糖、黄酮及生物碱均可不同程度的降低糖尿病小鼠的血糖，促进其肝糖元的合成，增加肝糖元含量[2-6]，增加糖尿病动物糖的贮藏能力，同时对其并发的血脂异常有一定的改善作用[7]。1-脱氧野尻霉素(DNJ)是桑叶中所特有的，且含量极高的生物碱类成分，黄酮类成分——芦丁的含量在桑叶中也很高，它们均为天然的α-糖苷酶抑制剂[8-11]，可作为治疗糖尿病、病毒感染、肿瘤转移及溶酶体储存紊乱等众多疾病的药物。自桑叶中提取降糖有效成分是现在的一个研究热点。

真空气流植物细胞破壁(vacuum air current for plant cell wall breakdown，VAPB)技术现主要应用于将果蔬干燥，并制成非油炸脆片。其原理是：将新鲜植物样品在密闭加压条件下进行加热，使细胞内水份急速汽化而使胞内压力迅速升高，然后对其进行瞬间减压，细胞壁因压力巨变而破碎，得到细胞破壁植物样品。保持破壁温度至样品干燥完全。此技术对植物细胞破壁率高，可达90%以上，且不改变药材的外观，温度可根据植物样品所含成分的性质进行控制。由于细胞壁的破碎，使内部的有效成分更易被溶剂溶出，可大大提高有效成分的提取量。但此项技术在中药成分提取的前处理过程中的应用报道较少[12-13]。本实验就此技术对桑叶中有效成分提取率的影响进行研究，将桑叶中多糖、生物碱、黄酮3类成分最大量的提取，可提高桑叶的药效，利于其应用开发。

1 材料与方法

1.1 材料

桑叶：真空气流细胞破壁与未破壁桑叶样品均由吉林省品品源生物科技有限公司提供，均为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，采集于2011年5月山东。桑叶经真空气流细胞破壁处理，电镜检测破壁率大于90%，即为破壁桑叶。分别粉碎，过60目筛，待用。

1.2 试剂与仪器

LC-2010高效液相色谱仪(SPD-10Avp紫外检测器；LC-Solution色谱工作站)、UV-1700分光光度计 日本岛津公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

芦丁标准品(批号0080-9750，纯度≥98%) 中国食品药品检定研究院；葡萄糖标准品(批号20110514，纯度≥98%) 中国医药集团上海化学试剂公司；DNJ标准品(批号WKQ0117，纯度≥98%) 四川维克奇生物科技有限公司；芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl，纯度≥98%) 上海共价化学有限公司；甘氨酸(纯度≥99%) 上海迈瑞尔化学技术有限公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯) 美国Fisher公司；纯净水 杭州娃哈哈集团；其余试剂及药品均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法测定桑叶中DNJ含量

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～30min为30%～60%A；检测波长：254nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

1.3.1.2 DNJ对照品溶液制备精密取DNJ标准品2.0mg，以甲醇定容至20mL，得0.1mg/mL的DNJ标准原溶液，从中分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL溶液，甲醇定容至1mL，得质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的DNJ标准溶液，过膜，备用。

1.3.1.3 样品溶液制备

取破壁和未破壁的桑叶各5.000g，分别用80%的乙醇溶液超声提取3次，30min/次，合并提取液，浓缩至干，用甲醇分别定容到10mL，得破壁和未破壁的桑叶样品原液。

1.3.1.4 柱前衍生化法测定DNJ的含量

分别取DNJ系列质量浓度标准溶液、破壁及未破壁样品原液各10μL于1mL容量瓶中，各加10μL硼酸盐缓冲液(pH8.5)及10mmol/L Fmoc-Cl乙腈溶液20μL，混匀后于20℃水浴反应20min，再加入10μL 0.2mol/L的甘氨酸，使过量衍生化试剂反应，以水定容至1mL，混匀后过0.45μm的微孔滤膜，得质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的DNJ的标准溶液和待测样品溶液。按1.3.1.1节进行DNJ峰面积值的测定，由线性方程求出样品液中DNJ的质量浓度。

1.3.1.5 标准曲线、线性范围和方法学考察

精密吸取衍生化的对照品溶液各20μL，进样，测定峰面积，以DNJ质量浓度(X)为横坐标，DNJ的峰面积(Y)为纵坐标，线性回归，得到回归方程：Y=3447430000X＋ 120459.6，R2=0.9992。线性范围为0.2～1.0μg/mL。取0.2μg/mL的衍生化对照品溶液，稀释成一系列的溶液，进行分析，确定DNJ检出限为0.02μg/mL(RSN= 3)。

精密度实验：取1.0μg/mL的DNJ对照品衍生溶液20μL，连续进样6次，测定峰面积。

稳定性实验：精密称取未破壁桑叶粉，按1.3.1.3、1.3.1.4节制成衍生化供试品溶液，于制备后0、1、2、4、6、8h进行测定。

重复性实验：精密称取2.500g未破壁桑叶粉6份，按1.3.1.3、1.3.1.4节分别制成供试品溶液，测定样品中DNJ含量。

加样回收率实验：精密称取6份已知DNJ含量的未破壁桑叶粉各1.000g，分别加入0.1mg/mL的DNJ溶液2mL，按1.3.1.3和1.3.1.4节分别制成供试品溶液，测定其中DNJ含量。

1.3.2 HPLC法测定桑叶中芦丁含量

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～10min为40%～50%A，10～15min时50%～55%A；检测波长：358nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

1.3.2.2 芦丁对照品溶液制备

精确称取芦丁标准品5.0mg，以甲醇定容至50mL，摇匀，配制成0.1mg/mL的芦丁标准溶液。从中分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以甲醇定容至1mL，配成质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的芦丁对照品溶液，过膜，备用。

1.3.2.3 样品溶液的制备

取1.3.1.3节制备的破壁与未破壁样品原液各2mL，以甲醇定容至10mL的容量瓶中，供测定芦丁含量用。

1.3.2.4 标准曲线、线性范围和方法学考察

精密吸取芦丁的对照品溶液各20μL，进样，测定峰面积，以芦丁质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，线性回归，得到回归方程：Y=27184495X＋ 20465.1，R2=0.9999。线性范围为0.0～0.1mg/mL。取0.02mg/mL的对照品溶液，稀释成系列溶液，进行分析，得芦丁检出限为0.002mg/mL(RSN= 3)。

精密度实验：取0.02mg/mL的芦丁对照品溶液20μL，连续进样6次，测定峰面积。

稳定性实验：精密称取1.000g破壁桑叶粉6份，按1.3.1.3节制成供试品溶液分别于0、1、2、4、6、8h进行测定。

重复性实验：精密称取1.000g未破壁桑叶粉6份，分别制成供试品溶液，测定样品中芦丁含量。

加样回收率实验：精密称取6份已知芦丁含量的未破壁桑叶粉各1.000g，分别加入1mg/mL的芦丁溶液1mL制成供试品溶液，测定其中芦丁含量。

1.3.2.5 样品中芦丁含量的测定

将1.3.1.3节制备的破壁及未破壁桑叶溶液20μL按照1.3.2.1节条件测定芦丁峰面积，由线性方程求出样品液中芦丁的含量。

1.3.3 分光光度法测定桑叶中多糖含量

1.3.3.1 葡萄糖对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖对照品25.0mg于25mL的容量瓶，加水溶解至刻度，得1mg/mL的葡萄糖标准贮备液。分别取葡萄糖标准贮备液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得质量浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/mL的葡萄糖系列对照品溶液。过膜，备用。

1.3.3.2 硫酸-蒽酮法测定桑叶中多糖含量[14]

精密吸取葡萄糖系列对照溶液及蒸馏水各1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，冰水浴5min，加入0.2%蒽酮硫酸试液4mL摇匀，立即置于沸水浴加热15min，取出，冷水冷却至室温，室温放置10min左右，于620nm波长处测定吸收度。以葡萄糖质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程：A=1.151ρ＋0.3714，R2=0.9994。线性范围为0.02～0.32mg/mL。

1.3.3.3 样品溶液的制备

取破壁和未破壁的桑叶各5.000g，分别置于索氏提取装置中，用石油醚(60～90℃)回流2h，再用95%乙醇回流2h，进行脱脂处理。残渣挥干溶剂，加水50mL，40℃超声提取3次，30min/次，合并提取液，用Sevag法(氯仿-正丁醇体积比4:1)去除蛋白，6000r/min离心20min，取上清液浓缩至5mL，加无水乙醇使乙醇含量达80%以上，静置12h，抽滤，得沉淀物，用乙醇和丙酮各洗脱3次，于60℃干燥得白色无定形粉末。将其以水定容于100mL容量瓶中，供多糖含量测定。

1.3.3.4 样品中多糖含量的测定

取1.3.1.3节制备的破壁及未破壁溶液各1mL，按照1.3.3.2节方法进行样品溶液的吸光度的测定，通过回归方程计算出多糖的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 DNJ的HPLC测定结果

参照文献[15-17]方法，对DNJ进行柱前衍生化，有效的去除了杂质，并在HPLC测定条件上进行了改善，采用乙腈-水梯度洗脱，DNJ衍生化产物的保留时间在18.7min左右，其他衍生化试剂吸收峰的保留时间大于29min，所得峰形对称，分离度高，干扰小，且避免了酸对色谱柱的损伤。色谱图见图1。

图 1 DNJ含量测定的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of DNJ

DNJ精密度实验，其保留时间的相对标准偏差(RSD)为0.37%(n = 6)，峰面积的RSD为1.32%(n = 6)，表明仪器精密度良好；稳定性实验，DNJ峰面积的RSD为0.52%(n = 6)，说明样品液在8h内基本稳定；重复性实验的RSD为1.98% (n = 6)，说明方法可行；加样回收率实验，加样回收率为98.76%，RSD为2.11%(n = 6)。经方法学考察，结果稳定，重现性好。

2.2 芦丁的HPLC测定结果

芦丁为酸性成分，采用HPLC法测定其含量时，流动相中常加入酸，以防止拖尾现象的产生[18-20]。本实验所建立的测定条件中，避免了酸的使用，且由图2可知，经方法学考察及样品中芦丁含量检测的应用，色谱峰分离度高，峰面积值稳定。

精密度实验，保留时间的RSD值为0.87%，峰面积的RSD 为1.59%，表明仪器精密度良好；稳定性实验，芦丁峰面积RSD值为1.12%(n = 6)，说明样品液在8h内基本稳定；重复性实验，RSD为1.41%(n = 6)，说明方法可行；加样回收率实验，加样回收率为99.07%，RSD为1.45%(n = 6)。

2.3 破壁与未破壁桑叶比较结果

由表1可知，经真空气流植物细胞破壁技术(VAPB)处理的桑叶，其DNJ、芦丁及多糖含量测定值均明显高于未进行破壁处理样品。破壁处理对多糖的测定值影响最小，为未破壁处理样品值的1.48倍；对DNJ及黄酮的影响则分别为1.74倍和1.58倍。

表 1 破壁与未破壁桑叶中DNJ、芦丁及多糖的测定含量(n=3)Table 1 Contents of DNJ, rutin and polysaccharose in mulberry leaf samples (n=3)mg/g

3 结 论

通过比较VAPB处理前后的桑叶样品中DNJ、芦丁及多糖含量的测定值可知，VAPB在桑叶有效成分提取过程中发挥了极大的作用，破壁较未破壁桑叶样品中的生物碱、黄酮及多糖含量的测定值分别高出74%、58%和48%，使有效成分溶出量显著提高，可使其药理活性得到更充分的发挥。将VAPB技术应用于其他植物中成分的提取具有极大的推广潜力。

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