2型猪链球菌与人结直肠腺癌细胞（Caco-2）黏附和侵袭作用的研究

叶淑超 福建省建瓯市畜牧兽医水产局 353100

猪链球菌病是由溶血性链球菌引起的一种人畜共患病。根据溶血现象把链球菌分为α、β和γ型，并根据猪链球菌的荚膜多糖抗原特性的差异，将其分为35个血清型（1-34型和1/2型）。2型猪链球菌（SS2）是毒力最强的血清型之一。目前研究SS2致病机理主要集中在两个方面。第一，通过黏附作用产生积液导致脑膜炎：当SS2进入体内后，先黏附于扁桃体黏膜细胞表面，刺激人体免疫系统产生巨噬细胞，引发炎症反应。此时大量细胞因子生成，产生渗液。渗液最后积聚，使人出现典型脑膜炎症状。第二，对机体非特异性免疫产生破坏作用：当SS2侵袭脉络丛上皮细胞时，预示着该菌开始破坏血脑脊液屏障。脉络丛上皮细胞是血脑屏障结构基础，而不同菌株对该屏障破坏作用不同。脉络丛中各种细胞因为炎性反应转录复制各种蛋白，同样在SS2感染的致病机理产生作用。多数学者从呼吸道感染途径对猪链球菌的致病机理进行大量研究，然而SS2是如何经消化道感染猪和人尚不明确，且对其传播机理的研究甚少。Enckevort等研究表明SS2可穿过肠壁到肠系膜淋巴结，并感染内脏器官，猪链球菌存在于环境的各种组成部分以及人体的各种器官中，当外界和肠道内环境发生变化时，就会改变肠上皮细胞的通透性，猪链球菌有可能侵入肠黏膜上皮穿过细胞层而感染机体。这显示肠道是SS2侵入的途径。因此，研究猪链球菌病消化道的传播途径十分重要，试验以消化道感染途径为切入点，应用现代分子生物学、免疫学和细胞学等方法，建立体外细胞感染模型，从细胞和分子水平上研究SS2经消化道黏膜感染的致病机理，揭示消化道感染可能是猪链球菌病一个潜在的重要传播途径，从而为深入研究SS2致病机理及机体的免疫调节提供理论依据，为研发2型猪链球菌病疫苗和药物作用靶点提供新的有效途径。

1 材料

Caco-2细胞，购于中国科学院上海生命科学研究院；2型猪链球菌1330（弱毒）株和458（强毒）株。

2 方 法

2.1 主要溶液的配制 （1）PBS（-）液：NaC120.0 g+KC110.5 g+Na2HPO4·12H2O 2.8 g+KH2PO40.5 g，先后溶于少量三蒸水中，然后定容至2 000 mL，磁力搅拌器上充分搅拌溶解，分装于250 mL瓶中，每瓶200 mL，高压30 min，4℃冰箱保存备用。细胞培养前添加青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL（双抗）（或根据需要添加3～4倍量双抗），分装，标记，4℃储存备用。（2）4%台盼蓝母液配制：称4 g台盼蓝加少许蒸馏水研磨，加双蒸水定容到100 mL，滤纸过滤，4℃保存。使用时用PBS（-）稀释 10倍至 0.4%，取9滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混合，3 min内测定细胞活力。（3）THB培养基配制：胰蛋白胨20 g+酵母浸出物3 g+葡萄糖2 g+NaC12 g+Na2CO32 g+牛肉膏5 g+NaHCO30.4 g，先后溶于少量三蒸水，定容至1 000 mL，磁力搅拌器上充分搅拌溶解，分装250 mL瓶中，每瓶200 mL，115℃高压20 min，将pH调至7.5～7.8。（4）感染培养基配制：100 mL DMEM培养基中加入10%胎牛血清、0.1%的50 mmo1/Lβ-巯基乙醇、0.2 gNaHCO3，将 pH 调至 7.2～7.4。

2.2 复苏细胞 （1）从液氮罐中小心取出冻存管，迅速浸没在37℃温水中快速均匀晃动，使冻存细胞溶液快速完全融解。（2）1 000 r/min离心10 min，弃上清，用DMEM培养基将细胞重悬，台盼蓝染色检测细胞活力后，调整细胞密度接种于24孔板。细胞成活率=活细胞数/总细胞数×100%。（3）将剩余的细胞悬液吸入装有完全培养液的培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%CO2条件下培养，每日更换培养液，约3～4 d传代一次。

2.3 细菌培养 （1）用THB平板复苏菌株，37℃培养24 h，挑单菌落接种于THB液体培养基。（2）培养18 h，再以1%量接种于THB液体培养基，培养至OD600为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，并同时分别涂布 THB平板，以测定SS2菌株的生长曲线。（3）测完4种SS2菌株的生长曲线后，取对数生长期的菌株，6 000 r/min离心15 min，弃上清，PBS重悬后6 000 r/min离心15 min，弃上清，再次PBS重悬后6 000 r/min离心15 min。（4）弃上清，加入感染培养液，并用感染培养液稀释成细菌：细胞=1：100的菌悬液。

2.4 黏附试验 （1）取对数生长期SS2菌液（5×108个/mL），8 000 g离心10 min，用PBS重悬后6 000 g离心，再重复一次。最后离心去上清，用感染培养液重悬。（2）取出细胞板，弃培养液，用PBS清洗3次以除去抗生素。（3）按照细菌细胞比100：1加入至细胞板中，用感染培养液定容至500 uL。（4）2 000 g离心5 min，以加强细菌细胞接触。（5）37℃孵育30 min，2 h和4 h之后弃培养液，用PBS洗6次，每次500 uL，最后4次涂板。（6）每孔加入200 uL胰酶，消化5 min，加入 300 uL PBS，吹打后稀释102、104、105、106，涂板。（7）2 h 时，在细胞板剩余孔中加入两个空白对照，即只加入细菌，不加细胞，与其他孔作相同处理，用PBS涂板。

2.5 侵袭试验 （1）取对数生长期细菌（5×108个/mL），6 000 g离心10 min，弃上清；PBS重悬后6 000 g离心，弃上清；再加入PBS重悬，6 000 g离心，后用感染培养液重悬。（2）取细胞板，吸取DMEM完全培养液，用1 mL PBS清洗3次，以除去抗生素。（3）按细菌细胞比100：1加入细菌，最后定容至1 mL。（4）2 000 g离心5 min，以加强细菌细胞接触。（5）37℃孵育2 h和4 h，弃感染培养液，用1 mL PBS洗6次，最后4次涂板。（6）每孔加入 500 uL1%TritonX-100，裂解物用 PBS 稀释 102、104、106、108涂板、培养。

3 结果与讨论

3.1 SS2（1330）细菌的生长曲线 用THB平板复苏菌株，37℃培养24 h，挑单菌落接种于THB，培养18 h，再以1%量接种于THB，培养至OD600为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，并同时分别涂布 THB 平板以测定SS2菌株的生长曲线，见图1。

由SS2生长曲线可知，SS2细菌的对数生长期在10～12 h，本试验采用过夜培养，所得到的细菌处于对数生长期，通过平板计数SS2为5×108个/mL。

图 1 SS2（1330）生长曲线

3.2 黏附与侵袭试验计数结果 SS2细菌细胞壁上有磷脂酸等，与动物皮肤及黏膜表面的细胞具有高度亲和力，其荚膜成分、M蛋白等具有抗吞噬作用，后者都是菌毛状，具有黏附作用。黏附和侵袭试验结果见表1-表2。

表1 细菌黏附试验结果

表2 细菌侵袭试验结果

洗液为PBS，第6次洗液计数都小于102，说明最后黏附和侵袭试验所计数都是与细胞发生黏附和侵袭到细胞内的细菌数，而排除了未发生黏附和侵袭作用细菌所造成的偏差。对照试验是在没有接种细胞的孔板上，对细菌进行相同处理，以排除组间差异。

通过平板计数结果可以看出：458#（强毒株）和1330#（弱毒株）都可以与Caco-2细胞发生黏附，并分析出458#比1330#更加容易黏附在细胞表面，事实上，458#比1330#更具有致病性。换句话说，容易发生黏附的细菌具有更强的致病性，由此推测，大部分致病性SS2能高水平黏附于消化道黏膜细胞上。

4 结论

1）猪链球菌同一血清型不同菌株之间以及不同血清型菌株之间的毒力有较大差异，并非所有的血清型均有致病性，且同一血清型的菌株不一定都引起相同的疾病，本试验结果也证实了这一点。

2）2型猪链球菌的1330株和458株对Caco-2细胞均具有黏附作用，458株的黏附和侵袭作用更强，表明细菌的黏附作用与其毒力有一定的关联。