头穴丛刺结合环境刺激对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后学习记忆能力影响的实验研究

刘波，邹伟，孔妍

(1．黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是指在围产期窒息缺氧等因素导致的脑部缺氧缺血性损害，是儿童致残的主要原因，给家庭和社会造成极大负担。本实验采用7日龄新生大鼠制备HIBD模型，给予头穴丛刺及环境刺激干预，观察HIBD大鼠学习记忆能力的影响。探讨头穴丛刺结合环境刺激治疗缺氧缺血性脑病患儿的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

7日龄Wistar大鼠80只(由上海斯莱克公司提供)，雌雄不限，体质量均在11～15g之间。随机分为假手术组(A)、造模组(B)、头穴丛刺组(C)、环境刺激组(D)、头穴丛刺加环境刺激组(E)。每组大鼠随机分为14天组、21天组，每组8只。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD动物模型。7日龄新生Wistar大鼠［1］，吸入适量无水乙醚麻醉，暴露颈部。局部碘伏消毒，做颈部正中切口，无菌分离左侧颈总动脉，并用外科6－0 灭菌手术丝线行双线结扎左侧颈总动脉，缝合伤口。手术结束后，将动物放回原饲养环境中恢复120min后，置于自制的有机玻璃缺氧箱中(保持37℃水浴恒温)，持续将体积浓度为8%氧气和92%氮气的混合气体以气流量为0.5l/min的速度输入缺氧箱中。术后出现平衡异常、不能翻身或夹尾左旋者视为造模成功，将其纳入实验。假手术组仅分离左侧颈总动脉，而不结扎，也不予以缺氧处理。

1.3 头穴丛刺和环境刺激

假手术组大鼠术后置于普通母鼠笼中饲养，不予任何治疗。造模组术后另置普通母鼠笼中饲养，不予任何治疗。头穴丛刺组大鼠采用丛刺法，按照“大鼠穴位图谱”［2］所示，取百会穴及百会左、右侧各旁开1mm处针刺。每穴快速捻转1min后留针120min，每日1次。环境刺激组每日将幼鼠与母鼠分离放入EE笼［3］内，给予EE干预120min。播放舒缓的轻音乐，并以明暗红色灯光照射。头穴丛刺加环境刺激组予以头穴丛刺后再将幼鼠放入EE笼中给予环境刺激120min，拔针放回母鼠笼中。

1.4 Morris水迷宫测试，

Morris水迷宫由黑龙江中医药大学针灸实验室提供。水迷宫为一直径150cm、高50cm的圆形不锈钢水池。在其上方安置带有显示系统的摄像机，及计算机分析系统可自动跟踪计时并同步记录大鼠的运动轨迹。用加热器使水温控制在(24±2)℃。在水池边缘标注东、南、西、北四个入水点，等分为四个象限，并于水池象限中间设立一个直径9cm、高29cm的透明有机玻璃平台，使平台顶低于水面下1cm处。测试时保持光线一致、室内安静。

1.4.1 定位航行实验

用于检测大鼠的学习和记忆能力。连续训练5天，每天训练4次。每天将大鼠面向池壁随机从4个象限中选取一个不重复的入水点放入水中，每次训练间隔时间为30s，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间为逃避潜伏期。如大鼠在1min内未找到平台，则以60s计算。各组大鼠以最后1天4次所用时间的总平均值作为观察指标。

1.4.2 空间探索实验

用于测量大鼠记忆保持能力。在第5天定位航行实验后撤除平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，观察其60s内穿越原平台所在位置的次数，测量4次取其平均值。

1.5 统计学分析

用SPSS 11.5 统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示。逃避潜伏期比较采用重复测量的方差分析;空间搜索实验中穿越目标次数及远期记忆潜伏期采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用LSD检验;两组间比较用独立样本t检验。P＜0.05 或P＜0.01 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定位航行实验

定位航行实验和空间探索实验A组与B组比较，有显著性差异(P＜0.01)，14天和21天后各治疗组C、D、E组与B组比较，有显著性差异(P＜0.01)。各组间评分比较见表1、图1。

2.2 空间探索实验 各组间评分比较见表2，图2。

图1 定位航行实验游泳轨迹图

图2 空间探索实验游泳轨迹

表1 逃避潜伏期(±s，s)

表1 逃避潜伏期(±s，s)

注:与 A组比较，＊＊P＜0.01;与 B 组比较，#P ＜0．05，##P ＜0.01;与 C组、D组比较，＆＆P ＜0.01。

A 15.42±5.26 12.16±5.49 B 8856.34±6.38＊＊ 48.12±4.36＊＊C 831.16±8.06## 25.69±4.25##D 28.35±4.69## 25.48±7.34##E 8 118.35 ±4.69##＆＆ 14.31 ±4.288##＆＆

表2 穿台次数(±s)

表2 穿台次数(±s)

注:与A组比较，＊＊P＜0.01;与 B组比较，##P＜0.01;与 C组、D组比较，＆＆P ＜0.01。

A 4.65±1.54 6.7±1.28 B 883.4±1.21* 3.1±1.65＊＊C 84.2±1.35# 4.7±1.52#D 4.1±1.05# 4.5±1.14#E 85.9 ±1.05##＆＆ 6.0 ±1.548##＆＆

3 讨论

学习记忆是脑的高级功能，而学习记忆的关键部位在海马。海马在情绪整合、认知和记忆等高级神经活动中作用重大。海马结构的可塑性是学习记忆的神经基础。海马CA1 区损伤后必将引起脑发育过程中功能和行为的异常［4］。

MorriS水迷宫是由MorriS发明并用于动物的学习记忆研究［5］。Arteni［6］采用双平台的水迷宫，通过轮流升起其中一个平台进行测量动物工作记忆的能力。而Markwoska［7］在空间探索实验阶段中发现，假使能够将平台间歇性的出现，可以更加敏感的测量动物的空间记忆能力。目前MorriS水迷宫实验对动物的运动轨迹运用专业软件进行分析，并对动物的行为进行实时摄像记录。MorriS水迷宫可作为记忆量化的良好指标反映动物空间学习记忆能力的形成和维持时间。

头穴丛刺是针灸专家于致顺教授在大量的临床经验和科研工作的基础上对头穴针刺系列研究的总结与深化。头穴丛刺法便于与康复技术结合，不同环境刺激，可以使脑的形态和功能产生不同的变化，而丰富环境刺激能够促进脑发育和各种脑损伤的修复。本实验采用头穴丛刺结合丰富环境刺激干预缺氧缺血性脑损伤新生大鼠。结果发现，14天、21天造模组与假手术组相比较逃避潜伏期明显延长，原平台象限游泳距离减少。但给予头穴丛刺和环境刺激后，缺氧缺血性脑损伤大鼠学习记忆能力显著改善。结果表明，尽管围生期缺氧缺血可以造成大鼠空间学习记忆能力的下降，如果早期干预给予头穴丛刺和环境刺激，可以明显改善大鼠学习记忆能力，甚至可能使学习记忆功能恢复到正常水平。

综上所述，缺氧缺血可造成学习记忆能力受到损伤，头穴丛刺结合环境刺激法能够促进脑损伤大鼠缺氧缺血后学习记忆能力的提高，其具体机制尚需进一步的实验研究。

［1］ 刘波，唐强，邢艳丽，等．头穴丛刺结合环境刺激对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马微管相关蛋白－2 和p38 表达影响的实验研究［J］．针灸临床杂志，2011，27(2):63－66．

［2］ 华兴邦，周浩良．大鼠穴位图谱的研制［J］．实验动物与动物实验，1991(1):1－5．

［3］ Rosenberg AA，Muydaugh E．The effect of blood glucogse consentration on postasphyxia cerebal hemodynamics in newborn lambs［J］．Pediatr Res，1990，27:454．

［4］ 孔妍，唐强，朱路文，等．缺氧缺血性脑损伤后针康法对幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白－2 表达的影响［J］．中国康复理论与实践，2011，17(4):310－312．

［5］ Morris R．Spatial locaalization does not require the presence of localcues［J］．Learning and Motviation，1981，12:239－260．

［6］ Arteni NS，Salgueiro J．Neonatal cerebral hypoxia ischemia causes lateralized memory impairments in the adult rat［J］．Brain Research，2003，973(2):171－178．

［7］ Markwoska AL，Spangler EL．Behavioral assessment of the senescence accelerated moues(SAM P8 and Rl)［J］．Physiol Behav，1998，64:15－26．