不同油茶品种叶片横切面解剖特征及其亲缘关系分析

郑 瑞，周方方，林 萍，姚小华，陆 畅，张小平，①

(1.安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖241000;2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江富阳311400)

油茶(Camellia oleifera Abel)又名茶子树、茶油树、百花茶，为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia Linn.)多年生常绿小乔木，是中国特有的食用油料树种，系世界四大木本油料树种之一。茶油以单不饱和脂肪酸为主要成分，且富含VA和VE等，营养价值高，素有“液体黄金”的美誉。近年来中国油茶种植业发展迅速，油茶种植面积迅速增加［1］。

油茶是中国南方最重要的木本食用油料树种，分布广、面积大，但产量低且不稳定。因此，培育高产、性能稳定的油茶新品种非常重要［2］。杂交育种是油茶育种的重要手段，但前提是必须对目前众多的油茶品种进行分类。

叶片作为植物的重要器官之一，其解剖学特征可作为种间或种下类群的分类依据。为此，作者采用石蜡切片法，从植物解剖学角度研究并探讨不同油茶品种叶片及其中脉横切面解剖结构的异同，分析其相关性和差异性，并在此基础上对供试的61个油茶品种进行比较与归类，以期为油茶品种分类提供形态解剖学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试61个油茶品种全部于2009年11月取自浙江富阳油茶基地(浙江东方红林场)，包括红花油茶系列(Honghuayoucha series)的6个品种‘dy46’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘hy1’和‘hy17’;长林系列(Changlin series)的 43个品种‘长林 27号’(‘Changlin 27’)、‘长林 21 号’(‘Changlin 21’)、‘长林91号’(‘Changlin 91’)、‘长林185号’(‘Changlin 185’)、‘长林 219 号’(‘Changlin 219’)、‘长林 15号’(‘Changlin 15’)、‘长林81号’(‘Changlin 81’)、‘长林 90 号’(‘Changlin 90’)、‘长林 94 号’(‘Changlin 94’)、‘长林 145 号’(‘Changlin 145’)、‘长林 152号’(‘Changlin 152’)、‘长林 20号’(‘Changlin 20’)、‘长林 29 号’(‘Changlin 29’)、‘长林31号’(‘Changlin 31’)、‘长林 40号’(‘Changlin 40’)、‘长林 46 号’(‘Changlin 46’)、‘长林 52 号’(‘Changlin 52’)、‘长林54 号’(‘Changlin 54’)、‘长林56号’(‘Changlin 56’)、‘长林 65号’(‘Changlin 65’)、‘长林 67 号’(‘Changlin 67’)、‘长林 72 号’(‘Changlin 72’)、‘长林82 号’(‘Changlin 82’)、‘长林87号’(‘Changlin 87’)、‘长林 88号’(‘Changlin 88’)、‘长林 89 号’(‘Changlin 89’)、‘长林 95 号’(‘Changlin 95’)、‘长林96 号’(‘Changlin 96’)、‘长林97号’(‘Changlin 97’)、‘长林 98号’(‘Changlin 98’)、‘长林99号’(‘Changlin 99’)、‘长林 100 号’(‘Changlin 100’)、‘长林101 号’(‘Changlin 101’)、‘长林 102 号’(‘Changlin 102’)、‘长林 106 号’(‘Changlin 106’)、‘长林119 号’(‘Changlin 119’)、‘长林 151 号’(‘Changlin 151’)、‘长林 153 号’(‘Changlin 153’)、‘长林155 号’(‘Changlin 155’)、‘长林 161 号’(‘Changlin 161’)、‘长林 162 号’(‘Changlin 162’)、‘长林 182 号’(‘Changlin 182’)和‘长林 214号’(‘Changlin 214’);湘林系列(Xianglin series)品种‘湘 5’(‘Xiang 5’);闽优系列(Minyou series)的5个品种‘闽优2’(‘Minyou 2’)、‘闽优6’(‘Minyou 6’)、‘闽优 10’(‘Minyou 10’)、‘闽优 11’(‘Minyou 11’)和‘闽优 43’(‘Minyou 43’);桐系列(Tong series)品种‘桐11’(‘Tong 11’);赣系列(Gan series)品种‘赣1’(‘Gan 1’);桂无系列(Guiwu series)品种‘桂3’(‘Gui 3’)和‘桂4’(‘Gui 4’);亚家系列(Yajia series)品种‘亚家 1’(‘Yajia 1’)以及作为对照的品种‘无’(‘Wu’)［2］。

从各品种的多棵样株上随机选取10片生长正常且大小一致的叶片［3］，用 FAA(含体积分数70%乙醇)固定。

1.2 石蜡切片制作方法

取固定后的油茶叶片，依次用体积分数50%、70%、85%、95%和100%乙醇(重复1次)、V(100%乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1(重复1次)、二甲苯(重复2次)梯度脱水和透明;然后逐级透蜡，透蜡时间为2 d。用石蜡切片机切片，切片厚度10 μm，番红－固绿对染，用中性树胶封片制成永久切片。

1.3 观察和测量方法

用Motic显微镜对切片进行观察并拍照。利用Motic软件进行测量，并用MATLAB软件对叶片解剖特征进行聚类分析［4］。

叶片横切面(除中脉)解剖结构特征包括叶片厚度、栅栏组织厚度和细胞层数、海绵组织厚度和细胞形状、栅栏组织与海绵组织的厚度比、上表皮厚度和下表皮厚度。每个品种随机选取10片叶片，每一叶片选3个横切面切片，每张切片观察3个视野，每个视野分别测量1个数据，即每个品种每项解剖特征测量90组数据，计算其平均值和标准差。并按以下公式［5］计算叶片组织结构疏松度(leaf tissue structure loose ratio，RL)和叶片组织结构紧密度(leaf tissue structure tense ratio，RT):RL=(海绵组织厚度/叶片厚度)×100%;RT=(栅栏组织厚度/叶片厚度)×100%。

叶片中脉解剖结构特征包括叶片中脉厚度、木质部厚度、韧皮部厚度、维管束短径、韧皮部厚度与维管束短径比、木质部厚度与维管束短径比、维管束短径与叶脉厚度比。每个品种随机选取10片叶片，每一叶片选取3个中脉横切面切片，每张切片观察3个视野，每个视野分别测量1个数据，每个品种每一指标共获得90组数据。按以下公式［5］计算叶片中脉突起度(midrib protuberant degree，MPD):MPD=叶片中脉厚度/叶片厚度。

2 结果和分析

2.1 叶片横切面解剖结构比较

供试61个油茶品种叶片横切面的解剖结构及各指标的测量数据见图版Ⅰ和表1;叶片中脉横切面的解剖结构及各指标的测量数据见图版Ⅱ和表2;部分品种叶肉组织中晶体和石细胞形态见图版Ⅲ。

表1 不同油茶品种叶片横切面解剖特征比较(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表1 不同油茶品种叶片横切面解剖特征比较(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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续表1 Table 1(Continued)

2.1.1 叶片横切面(除中脉)解剖特征分析 从表1和图版Ⅰ可以看出:供试的61个油茶品种叶片(除中脉外)横切面均由上表皮和下表皮以及栅栏组织和海绵组织构成，叶片多为典型的异面叶。

油茶叶片的上表皮和下表皮均由1层排列紧密的近方形扁平细胞组成，上表皮厚度为19.00～36.18 μm，下表皮厚度为14.05 ～35.45 μm，大多数油茶品种叶片上表皮的厚度大于下表皮;有表皮毛;上表皮和下表皮均被角质层，且均在中脉处有所加厚;供试61 个品种的叶片厚度为 401.13 ～729.68 μm。栅栏组织由2～4层长柱形细胞组成，排列紧密，细胞层数多为3～4 层，厚度为116.8 ～271.3 μm;海绵组织细胞形状多为椭圆形，排列较疏松，细胞间隙较大，厚度为198.2～518.4 μm。栅栏组织厚度与海绵组织厚度的比值为0.225～1.013，叶片组织结构疏松度为38.8% ～89.5%，叶片组织结构紧密度为17.2% ～44.6%。差异显著性分析结果表明:上述各指标在供试61个油茶品种间均存在显著差异(P＜0.05)。

另外，在大部分叶片组织中含有石细胞和晶体。石细胞多集中在叶脉附近，晶体散布在海绵组织的大细胞内(图版Ⅲ)。

2.1.2 叶片中脉横切面解剖特征分析 从图版Ⅱ可以看出:叶片中脉在叶片的上表皮和下表皮处均形成突起，中脉由厚角组织、维管束和维管束鞘组成。厚角组织由大而圆的薄壁细胞构成;维管束呈扇形，维管束鞘由2层薄壁细胞组成。维管束包含木质部、韧皮部和形成层3部分;木质部位于近轴端，韧皮部位于远轴端，且木质部多于韧皮部。

由表2可见:油茶叶片的中脉厚度为532.6～1 317.8 μm，其中，木质部厚度 116.1 ～364.2 μm，韧皮部厚度 40.0 ～181.8 μm。维管束短径 171.8 ～529.5 μm，中脉突起度为 1.029 ～2.041，韧皮部厚度与维管束短径比为0.197～0.431，木质部厚度与维管束短径比为0.578～0.797，维管束短径与中脉厚度比为0.253～0.659。差异显著性分析结果表明:上述各指标在供试61个油茶品种间差异显著(P＜0.05)。

表2 不同油茶品种叶片中脉横切面解剖特征比较(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表2 不同油茶品种叶片中脉横切面解剖特征比较(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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续表2 Table 2(Continued)

2.2 基于叶横切面解剖学性状的聚类分析

基于叶片及中脉横切面解剖结构特征对供试的61个油茶品种进行聚类分析，其聚类分析的树状图见图1。

聚类分析结果显示:基于叶片和中脉横切面解剖结构特征，可将供试的61个油茶品种分为13个组，其中，品种‘dy46’、‘长林 27号’、‘长林 21号’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘湘 5’、‘长林 91 号’、‘长林185号’和‘长林219号’分别单独成组(分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ组);品种‘hy1’和‘hy17’聚为一组(Ⅺ组);品种‘长林15号’、‘长林81号’、‘长林 90号’、‘长林 94号’、‘长林 145号’和‘长林152号’聚为一组(Ⅻ组);供试的其他43个油茶品种聚为一组(ⅩⅢ组)。

图1 基于叶片横切面解剖特征的61个油茶品种的聚类图Fig.1 Cluster dendrogram of 61 cultivars of Camellia oleifera Abel based on anatomical characteristics of leaf transection

2.3 分类检索表

为便于油茶品种的鉴定和评估，综合油茶品种叶片解剖特征的观察结果，对聚类分析划分的13个组编制相应的分类检索表:

基于叶片横切面解剖特征的13组油茶品种的分类检索表

3 讨 论

3.1 叶片解剖结构的差异分析

供试61个油茶品种中，长林系列品种是从来源不同的野生油茶上通过嫁接获得的品种，而红花油茶系列品种以及湘林、赣、桂无、桐、亚家、闽优系列品种均代表来自不同地区的油茶品种。它们在叶片解剖结构上具有不同特征，具体表现在以下几个方面:

1)表皮厚度:不同油茶品种间上、下表皮厚度的变异幅度较大。其中，品种‘长林91号’叶片上表皮厚度和下表皮厚度都较薄，说明该品种抗寒能力较弱;品种‘长林27号’上、下表皮厚度都较厚，说明该品种抗寒能力较强，且其中脉突起程度明显，也是其抗寒能力较强的佐证之一［6］。

2)叶片和中脉厚度:不同品种间叶片和中脉厚度变幅较大。其中，‘长林219号’、‘fy7’和‘hy114’中脉较厚，‘长林97号’、‘长林87号’和‘长林96号’中脉厚度较小;‘长林15号’、‘fy7’和‘hy114’叶片较厚，‘长林96号’、‘长林97号’和‘长林89号’叶片较薄，可以看出叶片厚度与中脉厚度呈一定的正相关关系。‘长林219号’和‘hy114’的中脉突起度相对较大，‘长林96号’和‘长林97号’的中脉突起度相对较小，说明中脉突起度与叶片厚度、中脉厚度有一定的正相关关系。中脉突起度与叶片水分运输有关，所以红花油茶系列品种的耐旱性较强。

3)叶肉组织结构:不同品种的栅栏组织和海绵组织厚度变幅均较大，其中海绵组织厚度变幅大于栅栏组织厚度;由此也导致叶片组织结构疏松度和紧密度变异较大。其中，‘长林162号’和‘长林82号’的叶片组织结构紧密度较大，‘dy156’、‘fy7’、‘hy114’、‘hy17’和‘hy1’叶片组织结构紧密度较小，但它们的中脉突起度都比较大，说明红花油茶系列品种叶片栅栏组织不是很发达，光合效率不高且耐寒性弱［7］。

3.2 油茶耐寒性与叶解剖结构的关系分析

基于前期关于耐寒性的研究结果，结合叶片解剖结构的观察结果，可以认为:叶片厚度、叶片组织结构紧密度和疏松度等指标与油茶的抗寒性关系不大，而叶片上表皮厚度、气孔密度和中脉突起度等指标与抗寒性关系密切;气孔密度小、叶表皮厚且中脉突起度大，则抗寒性强;反之则抗寒性弱［8］。

3.3 油茶品种间亲缘关系的分析

通过聚类分析可将供试的61个油茶品种分为13个组，其中，闽优系列品种均来自福建，表现出较近的亲缘关系。‘hy1’与‘hy17’同为红花油茶系列，表现出一定的相似性。另外，不同的分组具有各自的显著特征，如:组Ⅱ、组Ⅶ和组Ⅹ品种的中脉突起度与其他分组差异较明显;组Ⅲ和组Ⅻ品种的韧皮部厚度与其他分组差异较明显;组Ⅳ品种在叶片组织结构疏松度上与其他分组差异较明显;组Ⅴ品种在叶片组织结构紧密度上与其他分组有明显差异;组Ⅸ品种在维管束短径长度上与其他分组差异明显。

因此，油茶叶的解剖学特征可作为区分种或品种的依据，对种间亲缘关系探讨具有一定意义。

［1］林 萍，姚小华，王开良，等.油茶长林系列良种分类系统检索表［J］.林业实用技术，2009(10):24－25.

［2］庄瑞林.我国油茶良种选育工作的历史回顾与展望［J］.林业科技开发，2010，24(6):1－5.

［3］林 萍，姚小华，王开良，等.油茶长林系列优良无性系的SRAP分子鉴别及遗传分析［J］.农业生物技术学报，2010，18(2):272－279.

［4］林秀艳，彭秋发，吕洪飞，等.山茶属油茶组和短柱茶组叶解剖特征及其分类学意义［J］.植物分类学报，2008，46(2):183－193.

［5］唐立红，赵雪梅，朱 月，等.自然降温过程中紫斑牡丹叶片结构与抗寒性关系的研究［J］.北方园艺，2012(11):64－66.

［6］孟庆杰，王光全，董绍锋，等.桃叶片组织结构与其抗旱性关系的研究［J］.西北林学院学报，2005，20(1):65－67.

［7］李国华，徐 涛，陈国云，等.10个品种澳洲坚果叶片解剖学的比较研究［J］.热带作物学报，2009，30(10):1437－1441.

［8］覃秀菊，李凤英，何建栋，等.广西茶树新品种品系叶片解剖结构特征与特性关系的研究［J］.中国农学通报，2009，25(10):36－39.