玉屏银屑方对湿热证型银屑病动物模型T淋巴细胞亚群的影响

★ 王玉芝（山东中医药大学 济南250014）

大量研究证实银屑病早期皮损以CD4+T淋巴细胞浸润为主，而慢性皮损则以CD8+T淋巴细胞浸润为主[1]。本实验制造了湿热证型银屑病病证结合动物模型，并在造模同时预防性应用玉屏银屑方，通过应用流式细胞仪检测各组实验动物CD4+∕CD8+比值，来观察预防性应用玉屏银屑方对造模动物细胞免疫功能的影响。

1 实验方法

1.1 材料与方法

1.1.1 动物与分组 动物：纯白哈德莱普通级豚鼠70 只，体重230g-250g，雌雄不限，济南西岭角养殖繁育中心提供，合格证号：SCXK 鲁20100005。分组：70 只豚鼠随机分为4 个组，正常对照组（Ⅰ组）10 只、银屑病组（Ⅱ组）20 只，湿热证型银屑病造模组（Ⅲ组）20只，玉屏银屑方组（Ⅳ组）20只。

1.1.2 主要试剂和仪器Mouse anti-Rat PC5-CD3，FITC-CD4，PE-CD8 由BD Pharmlgen 公司提供；气候模拟仓由济南昊昱温室工程公司按照实验要求尺寸定做；病理标本采集分析工作由山东中医药大学附属医院病理科协助完成。

1.1.3 主要药物 心得安，山西制药有限公司产品，生产批号：B120405；乳剂基质由山东中医药大学附属医院皮肤科提供；按要求配制成5%心得安乳剂备用。玉屏银屑方组成：黄芪20g，白术10g，防风10 g，金银花20 g，柴胡10 g，土茯苓20 g，薏苡仁30 g，车前草30 g，白花蛇舌草20 g，板蓝根20 g，紫草10 g，生地20 g，丹皮10 g，赤芍10 g，购自山东中医药大学附属医院。煎制法：将药物洗净切碎，加水浸泡1 小时后，水煎2 次，合并其滤液，取煎液约100mL，浓度为2.4mg∕mL，置4℃冰箱中冷藏备用。红星二锅头酒（酒精度为55度），蜂蜜、猪油等市售。

1.2 动物模型制作方法

1.2.1 正常对照组（Ⅰ组）：标准饲料、自由饮水及自然环境饲养6周。

1.2.2 银屑病组（Ⅱ组）：采用黄畋法[2]制造豚鼠耳部的银屑病样动物模型。即：标准饲料、自由饮水及自然环境饲养3 周，自第4 周开始与Ⅲ组同时，以5%心得安乳剂均匀涂于豚鼠耳背（1cm2用药0.3g，涂匀），每日3 次，厚度为1.0mm，连续3 周。作为与Ⅳ组对照，从第2周开始给于生理盐水灌胃，1mL，1日1次，共5周。

1.2.3 湿热证型银屑病造模组（Ⅲ组）：湿热环境+高脂高糖饮食+白酒+涂药。造模豚鼠适应性喂养1周，第2 周开始在标准饲料喂养的基础上，加用200g∕L蜂蜜水自由饮用，并按豚鼠体质量灌服油脂10g∕kg，2 日1 次，并与油脂隔日灌服10mL∕kg 白酒，共2周后，以心得安乳剂外涂豚鼠双耳背皮肤（同Ⅱ组）3 周，并自涂药当天起隔日放入温度为（32±2）℃，相对湿度为（95±5）%的人工气候箱中，共3次，每次3小时。亦从第2周起用生理盐水灌胃，共5周。

1.2.4 玉屏银屑方组（Ⅳ组）造模方法与Ⅲ组相同，造模同时给予玉屏银屑方灌胃。造模豚鼠适应性喂养1 周后，按照人与动物公斤体重比值进行药物剂量的折算[3]每天给予玉屏银屑方1.5mL，灌胃，至造模结束共5 周，同时给予高脂高糖饮食加白酒2周后，耳背涂药3周并隔日放入气候箱3次。

1.3 检测、观察指标

1.3.1 主要症状、体征的观察 注意观察各组豚鼠的一般情况、饮食、二便、毛发及耳背皮肤的变化等情况。监测各组豚鼠的直肠温度及体重的变化。

1.3.2 病理标本采集 造模结束后，禁食12小时，自由饮水，豚鼠麻醉后，迅速取下耳部标本，置于10%甲醛溶液中固定，进行病理制作、Baker法组织评分和炎症细胞计数。

1.3.3 流式细胞仪检测各组动物CD4+∕CD8+比值 在山东省医科院进行，造模结束后，腹主动脉取血，置入EDTA抗凝管，然后进行样品的制备，上机检测。

2 结果

2.1 主要症状、体征的观察

2.1.1 一般情况 死亡情况：Ⅲ组、Ⅳ组因灌胃不当，分别死亡2只、3只。Ⅱ组动物自造模1周后出现精神差，反应迟钝，进食减少，体重增长放缓，毛发无光泽、易脱落，肛温正常。3周后上述症状加重同时出现搔抓耳部现象。Ⅲ组动物造模前期体重增长较快，精神正常，后期放人工气候箱以后体重增长变缓，并有部分豚鼠体重减轻，纳呆少饮，嗜睡懒动，大便时干时溏，肛温升高明显。Ⅳ组动物与Ⅲ组相比，耐受湿热能力增强，体重下降出现较晚，嗜睡、纳呆、便溏等症状较轻。

2.1.2 豚鼠双耳外观皮肤形态Ⅱ组豚鼠涂药2 周后，毛发部分脱落无毛根，部分耳背毛细血管扩张明显；3周后7只动物耳背皮肤红肿，覆盖着少量脆屑样细小银白色鳞屑。Ⅲ组豚鼠耳背皮肤银屑病样模型出现的更早更典型：5只豚鼠涂药3-5天，即出现耳背毛发部分脱落无毛根，耳背毛细血管扩张，其余13 只在涂药6-7 天开始出现同样改变；涂药2周后，皮损红肿，部分豚鼠覆盖着少量脆屑样细小银白色鳞屑，；3周后12只鳞屑增多，已呈现典型的银屑病样皮损。Ⅳ组症状较Ⅲ组明显出现的晚：平均涂药12 天后，耳背毛发部分脱落无毛根，部分毛细血管扩张明显；3 周后8 只覆盖着少量脆屑样细小银白色鳞屑，出现典型银屑病症状。

2.2 豚鼠耳背皮肤病理学改变

Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组镜下均出现典型银屑病病理表现，其中Ⅱ组2 例、Ⅲ组4 例、Ⅳ组2 例，角化不全部位可见Munro小脓疡；颗粒层变薄或消失。经统计学处理Baker评分及炎症细胞浸润数Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组均显著高于Ⅰ组，Ⅱ组与Ⅲ组比较亦出现差异性，Ⅲ组评分高于Ⅱ组，而Ⅳ组评分低于Ⅲ组（见表1）。

表1 各组豚鼠Baker 评分及炎症细胞浸润情况评估

2.3 各组实验动物CD4+∕CD8+比值

（1）CD4+方面：Ⅱ组、Ⅲ组均高于Ⅰ组（P＜0.05），说明银屑病进展期CD4+显著升高，而Ⅳ组比Ⅰ组亦升高但无统计学意义；（2）CD8+方面：各组均无显著性差异；（3）CD4+∕CD8+比值：Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组与Ⅰ组比较均显著增高（P＜0.05），且Ⅲ组显著高于Ⅱ组，而Ⅳ组比Ⅲ组有明显下降（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组实验动物CD4+∕CD8+比值

3 讨论

玉屏银屑方乃山东中医药大学附属医院皮肤科杜锡贤教授的经验方，多用于银屑病患者临床治愈或稳定后的巩固治疗，可延缓或减少银屑病的复发，王建青博士已在临床研究中给以证实[4]。杜教授将银屑病缠绵难愈和易复发的原因总结为“三久一固”：久病多虚，久病多湿，久病多瘀，固疾多毒。而本方扶正祛邪兼顾，针对银屑病复发的病因，起到调节免疫，从而防止复发的效果。

本实验造模结束时观察到，银屑病与湿热证的病证结合模型同时出现嗜睡懒动，纳呆少饮，大便时干时塘，肛温升高，血脂升高等典型的湿热证表现和耳背皮肤典型银屑病样表现；且其银屑病症状较单纯心得安外涂组出现的更早、更典型，病理评分亦增高；同时CD4+∕CD8+比值也比银屑病组有显著性升高。而预防性应用玉屏银屑方组与湿热证型银屑病动物模型组相比则有效减缓了银屑病症状的出现，组织病理Baker 评分和炎症细胞浸润也有显著降低。在免疫方面发现CD4+∕CD8+的比值显著降低，其中主要以调节CD4+水平为主。目前国内外关于银屑病检测T 淋巴细胞亚群的报道很多，但结果并不一致，本研究发现银屑病的发生发展早期可能与CD4+T淋巴细胞浸润有关。

通过本实验充分说明了湿热因素在银屑病的发生、发展过程中的重要作用，证实了杜锡贤教授的“皮肤病湿热潜证”的观点，另一方面也验证了玉屏银屑方在预防银屑病效果切实可靠。同时为了便于患者的长期预防用药，我们多改用免煎中药来保证疗程，同时配合认知行为干预及放松训练，使银屑病真正成为一种可防、可治、可控的疾病，从而增强患者战胜疾病的信心。

[1]Onuma S Imm unoh is tochem ical studies of infiltrating cells in early and chronic of psoriasis[J].Dem atol，1994，21（4）：223-232.

[2]黄畋，张淑芝，孙令.普萘洛尔涂药造成豚鼠耳部银屑病样病理变化[J].中华皮肤科杂志，1991，24：96-97.

[3]施新猷.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社，2001，第1版：332-335.

[4]王建青.治未病理论在复发型寻常型银屑病防治中的应用研究[D].山东中医药大学2011届博士研究生学位论文.