二次正交旋转组合设计优化香菇废菌棒蛋白质的提取工艺

陈海燕，刘青娥，钟仙龙，肖建中

(丽水学院，浙江丽水323000)

香菇废菌棒为香菇出菇采集后留下的菌棒。据有关资料和专家研究表明，废菌棒中有大量的菌丝存在，而菌丝中含有粗蛋白质等营养物质未被利用，具有较高的开发利用价值［1-2］。近年来，我国食用菌产业得到快速发展，目前已成为世界食用菌第一生产国、出口国和消费国。2004年，我国食用菌总产量达1160万 t，占世界总产量的80%，全球贸易的40%［3］。废菌棒除部分作为燃料被烧掉外，大多数是长期堆放在菇场四周任其腐烂，有的则倾倒在水塘、溪沟、河水之中，长期浸泡、四处漂流，不仅影响以后种菇的产量和质量，而且造成严重的环境污染，这是摆在环保面前的一大难题。本文采用二次正交旋转组合设计对香菇废菌棒蛋白质提取工艺进行优化，其目的旨在为从香菇菌棒中提取蛋白质的工业化生产提供理论依据，同时还实现了废弃物资源的再利用，对促进食用菌产业与环境和谐具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香菇939废菌棒 浙江省丽水市仙都乡，将其烘干粉碎过40目筛;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、氢氧化钠、硫酸铵、丙酮、乙醇、盐酸等 均为分析纯。

722型可见分光光度计 上海光谱有限公司;BS210S电子分析天平 北京赛多利斯;HWS-26恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;TDL-40B离心机 湖南星科科学仪器有限公司;GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱 江苏宏凯仪器厂。

表1 四因素二次正交旋转组合实验设计因素水平编码表Table 1 Factors and code levels of experiments

1.2 提取方法

采用碱法从香菇废菌棒提取蛋白质，其提取方法如下:称取废菌棒粉1g于洁净的锥形瓶中，加入预定量的不同碱浓度的提取液，室温下静置10min后，于一定条件下进行提取，离心(3000r/min，15min)，收集上清液，采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量。

1.3 香菇废菌棒蛋白质提取工艺单因素实验

1.3.1 碱浓度对蛋白质提取量的影响 分别调节碱浓度至0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mol/L。称取1g废菌棒粉，置于洁净的锥形瓶中，加入30mL不同碱浓度的提取液，摇匀;室温静置10min后于40℃浸提90min，离心分离(3000r/min，15min)，收集上清液，在595nm下测定蛋白质含量。

1.3.2 浸提温度对蛋白质提取量的影响 称取1g废菌棒粉于锥形瓶中，加入30mL 0.12mol/L的提取液，摇匀;室温静置 10min 后，分别在 4、10、20、30、40、50、60、70、80℃不同的温度下浸提 90min，离心收集上清液，在595nm下测定蛋白质含量。

1.3.3 浸提时间对蛋白质提取量的影响 称取1g废菌棒粉，于洁净的锥形瓶中，加入30mL、0.12mol/L的提取液，室温静置10min后，在70℃下分别浸提30、60、90、120、150、180min，离心收集上清液，用于蛋白质含量测定。

1.3.4 液固比对蛋白质提取量的影响 称取1g废菌棒粉于锥形瓶中，分别按 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1 液固比加入碱浓度为0.12mol/L的提取液，室温静置10min，在70℃下提取90min，离心收集上清液，在595nm下测定蛋白质含量。

1.4 四因素二次正交旋转组合设计

在以上单因素实验基础上，选择影响蛋白质提取量的四个主要因素碱浓度、浸提温度、液固比、浸提时间的实验水平，以香菇废菌棒蛋白质提取量为考察指标，采用4因子2次正交旋转组合设计(全实施)，优化香菇废菌棒中蛋白质提取工艺的最佳参数，其因素水平编码表见表1。

1.5 蛋白质含量的测定

香菇废菌棒提取液中蛋白质含量的测定采用Bradford检测法［4］。以结晶牛血清白蛋白为标准蛋白通过考马斯亮蓝G250染色法制定标准曲线，得回归方程y=4.8094x+0.0113(x为蛋白质(mg)，y为吸光值)，R2=0.9957。同法测定样品提取液中蛋白质吸光值，根据回归方程计算香菇废菌棒蛋白质质量。

香菇废菌棒蛋白质提取量(mg/g废菌棒粉)=蛋白质质量(mg)/废菌棒粉质量(g)

1.6 统计方法及分析软件

采用4因子2次正交旋转组合设计，利用DPS9.50分析软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 碱提过程中各单因素对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响

2.1.1 不同碱浓度对蛋白质提取量的影响 由图1可知，在碱浓度为0.02～0.16mol/L范围内，随着碱浓度的提高，蛋白质提取量明显上升，当碱浓度为0.16mol/L时，其蛋白质提取量达到最大，为1.930mg/g。这表明，提高碱浓度有利于蛋白质提取量的提高，为了获得较高得率，应选择较高的碱浓度。但是碱浓度过高，可能会破坏蛋白质的生物活性，使其变性。且有研究表明，碱性太强可引起脱氨、脱羧、肽键断裂，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物［5］。因此本实验选择0.12mol/L为最佳的碱浓度。

图1 碱浓度对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响Fig.1 Effect of alkali concentration on yield of protein in Lentinus edodes waste

2.1.2 浸提温度对蛋白质提取率的影响 浸提温度对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响如图2所示。在4～70℃，随着温度的升高，蛋白质提取量也在不断增加。当浸提温度为70℃时，香菇废菌棒蛋白质提取量达到最大，为1.22mg/g。但当温度高于70℃时，蛋白质的提取量反而随温度升高而下降。这可能是由于细胞溶胀破碎的程度随温度升高而增加，温度过低不利于蛋白质的溶出，但温度过高容易引起蛋白质的变性，破坏蛋白质结构和生物学活性。综合考虑能效比，选择70℃为最佳的浸提温度。

2.1.3 浸提时间对蛋白质提取量的影响 由图3可知，浸提时间越长，蛋白质的得率越高。当时间超过90min后，得率增加量变小，即再延长浸提时间，得率也不会有较大增加。综合考虑能源稍耗、生产周期、生产成本，浸提时间不宜延长。因此本实验最佳的浸提时间为90min。

图2 浸提温度对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

图3 浸提时间对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

2.1.4 液固比对蛋白质提取量的影响 将香菇废菌棒粉放入不同比例的浸提液中，研究液固比对蛋白提取量的影响，结果如图4所示。在液固比为10∶1～50∶1范围内，蛋白质提取量开始随加液量增加而增加。当液固比为10∶1时，蛋白提取量为0.65mg/g，远低于其它实验组，这可能是由于香菇废菌棒中含有一定量的纤维，具有较强的吸水膨胀能力，使物料因流动性差而难于搅拌，导致蛋白提取量过低［6］。液固比为50∶1时，蛋白质的提取量最大，为1.33mg/g，但当继续增加碱液量至液固比达到55∶1后，提取量开始逐渐降低。

图4 液固比对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响Fig.4 Effect of ratio of solvent to material on yield of protein in Lentinus edodes waste

2.2 二次正交旋转组合设计优化香菇废菌棒蛋白提取工艺

2.2.1 实验结果 在以上单因素实验基础上，以香菇废菌棒蛋白质提取量为考察指标，采用4因子2次正交旋转组合设计(全实施)，优化香菇废菌棒中蛋白质提取工艺的最佳参数。每个因素5个水平，共36个组合，实验结果见表2。

表2 二次正交旋转组合实验设计及实验结果Table 2 Design and results of experiments

2.2.2 回归方程的建立与检验 采用DPS9.5统计软件对表2的数据进行分析，得香菇废菌棒蛋白质提取量与各因子之间的回归方程为:

Y =2.14342 +0.07883X1+0.14208X2+0.07008X3-0.05969X12+0.00856X22-0.04906X32-0.02912X3X4。经二次回归方程分析表明(如表3)，碱浓度和温度的一次项均达到了极显著水平(p＜0.01);浸提时间的一次项和二次项，以及碱浓度二次项达到了显著水平(p＜0.05);而液固比以及四因素间的交互作用无显著性差异(p＞0.05)。由于设计具有正交性，各回归系数之间无相关性，因此可直接剔除模型中的不显著项建立回归方程。因此，剔除不显著项后，简化后的回归方程为:Y=2.14342+0.07883X1+0.14208X2+0.07008X3+0.05100X4-0.05969X12-0.04906X32。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Sequential model sum of squares

为检验回归方程的有效性，对回归方程进行失拟性检验。由表 3可知，失拟项不显著(F1=2.19357，p＞0.05)，即回归方程对实验点拟合较好。回归方程达到极显著水平(F2=4.42724，p＜0.01)，即实验所选择的四个因素对香菇废菌棒中蛋白质溶出效果有显著的影响，由此可以认为上面给出的二次回归方程模型是合适的。

2.2.3 主因素效应分析

由表3可知，各因素对蛋白质提取量的影响从大到小的排序为温度＞碱浓度＞浸提时间＞液固比。因此调控好这四个主要因素各自的最佳提取范围，就能有效的提高香菇废菌棒蛋白质的提取量。

2.2.4 单因素效应分析 将其他因素固定在零水平条件下，分别研究 X1(碱浓度)、X2(浸提温度)、X3(浸提时间)及X4(液固比)对蛋白质提取量的影响(图5)。

图5 各因素对香菇废菌棒蛋白质提取量的影响Fig.5 Effect of single factor on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

在-2≤Xi≤2的范围内，温度和液固比与可溶性蛋白质得率的关系接近线性，表明这两个因素作用显著，随着温度和液固比的增加，有利于香菇废菌棒蛋白质得率的提高;时间和碱浓度与蛋白质得率均呈开口向下的抛物线关系，表明两因素均存在一个合理范围，即对蛋白质提取量影响都呈先上升后下降的趋势。

2.2.5 香菇废菌棒蛋白质提取工艺条件的优化与验证 通过模型对最优碱浓度、浸提温度、浸提时间及液固比进行预测，得出最优提取条件为碱浓度0.11mol/L，浸提温度72℃，浸提时间104min，液固比47∶1，在此条件下蛋白质得率2.38mg/g。根据得到的最优工艺参数，开展3次平行验证实验，得到的实测值为2.42mg/g，与预测值仅差0.04mg/g，验证结果显示方程预测性很好，与实际的偏差较小，说明此最佳模型是可靠的。

3 结论

碱溶液提取蛋白质具有提取率高、成本低的优点，适于工业化生产［7-8］。本文通过单因素实验和二次正交旋转组合设计，优化了香菇废菌棒蛋白质提取工艺。通过建立回归模型，综合各项模型拟合指标，本研究选用了二次模型来拟合本实验。经二次回归方程分析表明，碱浓度和温度的一次项均达到了极显著水平，浸提时间的一次项和二次项，以及碱浓度和温度的二次项达到了显著水平;而液固比以及四因素间的交互作用无显著性差异。对二次模型的主效应进行分析，排列出了四因素之间主次关系的顺序，依次为温度＞碱浓度＞浸提时间＞液固比。

另外，本研究使用了统计优选方法，对二次模型进行了寻优，最终确定了香菇废菌棒蛋白质得率的最优组合为碱浓度0.11mol/L，浸提温度72℃，浸提时间104min，液固比47∶1。在该条件下实验，重复三次，所得的蛋白质提取量平均值为2.42mg/g，与模型预测值仅相差0.04mg/g，说明该模型与实验相吻合，所优化的工艺参数准确可靠、稳定、可行，能够适用于生产实践。

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