急性子总皂苷的提取工艺

朱 娜,孟 磊,张培旭,姚 华,金永日,李绪文

(1. 吉林大学 化学学院,长春 130012；2. 吉林省环境监测中心站,长春 130011；3. 聚光科技股份有限公司,杭州 310052)

急性子为凤仙花科凤仙花属植物凤仙花(ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟种子,在夏、 秋季果实成熟而未开裂时采收,晒干,搓出种子[1]. 急性子微苦、 性温、 有小毒[2],有破血软坚和消积的功效. 主治经闭、 噎膈、 腹部肿块、 骨哽咽喉和外疡坚块,在临床可用于避孕、 终止早孕、 治疗食管贲门癌症和骨质增生等[3]. 急性子中含有皂苷、 黄酮、 挥发油、 萘醌及糖类等成分,其中具有较好抗肿瘤活性的皂苷类化合物含量最高[4-7]. 为得到更多的总皂苷有效组分,本文考察急性子中4种主要皂苷类化合物凤仙萜四醇苷A,B,C和K,通过优化影响总皂苷提取率的几种因素,建立了急性子总皂苷的最优提取条件,为急性子总皂苷药理作用研究提供了理论依据.

1 仪器与样品

Aglient1200型高效液相色谱仪;Aglient Eclipse XDB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱;Alltech2000型蒸发光散射检测器;Startorius YDO-OIR型电子天平;TYS-200型粉碎机(浙江永康红太阳机电有限公司);RE-201C型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂);SHZ-CB型循环水式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司). 色谱纯甲醇(美国Fisher公司);自制二次蒸馏水;回流用试剂均为分析纯(北京化工厂).

急性子药材购自安徽省亳州市,经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定为中药急性子,实验前将急性子药材粉碎过100目筛,混匀得急性子粉末. 对照品凤仙萜四醇苷K(化合物H1)、 凤仙萜四醇苷A(化合物H2)、 凤仙萜四醇苷B(化合物H3)和凤仙萜四醇苷C(化合物H4)均为自制,其质量分数分别为98.4%,99.3%,98.0%,99.7%.

2 测定方法

2.1 液相条件 由于急性子皂苷类化合物在紫外波长范围内无吸收,因此选择蒸发光散射检测器进行检测. 高效液相色谱检测条件为：流动相：0～20 min,V(甲醇)∶V(水)=46∶54;20～60 min,V(甲醇)∶V(水)=6∶4;柱温：t=25 ℃;流速：v=1.0 mL/min;进样量：20 μL. 蒸发光散射(ELSD)检测条件为: 漂移管温度t=91 ℃,载气流速为2.5 L/min ,放大系数为1.0,撞击器模式关.

2.2 对照品质量分数测定方法 分别称取对照品H1～H4各25.0 mg,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54溶解并定容至25.0 mL容量瓶中,摇匀,制得混合对照品溶液. 分别精密量取该标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至刻度,摇匀,配成0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,1.00 mg/mL的标准溶液. 分别取上述对照品溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪,以样品峰面积的常用对数对进样质量的常用对数进行线性回归分析. 结果表明,当进样质量为2.0～20.0 μg时,化合物H1～H4峰面积的常用对数值与进样质量的常用对数值均呈较好的线性关系. 对照品回归方程分别为：

化合物H1：lgY=1.648 4lgX+4.464 1,r=0.999 5;

化合物H2：lgY=1.566 4lgX+4.600 2,r=0.999 2;

化合物H3：lgY=1.476 9lgX+4.719 0,r=0.999 7;

化合物H4：lgY=1.593 8lgX+4.617 8,r=0.999 7.

2.3 急性子中化合物H1～H4质量比的测定 称取3份2.0 g急性子粉末,分别置于100 mL圆底烧瓶中,用12 mL体积分数为70%的乙醇回流提取5次,时间均为60 min. 将提取液过滤,合并,减压浓缩,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 按2.1中色谱方法及条件,测定提取物中化合物H1～H4的质量比,结果列于表1.

表1 急性子中H1～H4的质量比Table 1 Mass contents of H1—H4 in the seeds of Impatiens balsamina L.

3 实验方法及结果

3.1 提取溶剂的单因素考察 由于急性子皂苷类成分为极性较大的化合物,且化合物热稳定性好,因此选择极性较大的溶剂进行回流提取[8-9]. 本文选择水、 甲醇和乙醇作为溶剂进行单因素考察. 称取等质量急性子粉末,分别用V(液)∶m(料)=8的水、 甲醇和乙醇回流提取3次,将提取液过滤,合并,定容,按2.1中色谱方法和条件用HPLC-ELSD测定提取物中化合物H1～H4的质量比,以每克药材中提取得到的化合物H1～H4的质量以及它们的总质量(mg/g)衡量提取效果. 实验结果表明: 水的提取效果较差;甲醇和乙醇对H1～H4的提取效果较好,但甲醇毒性较大,因此选择乙醇作为回流提取溶剂.

3.2 不同体积分数乙醇对提取率的影响 称取急性子粉末2.0 g,共7份,分别用16 mL体积分数为90%,80%,70%,60%,50%,30%,20%的乙醇回流提取3次,回流时间分别为60,45,30 min. 过滤,合并提取液,减压浓缩,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液按2.1中色谱条件及方法测定提取物中H1～H4的质量比,以每克药材提取得到的化合物H1～H4的质量以及它们的总质量衡量提取效果,结果列于表2.

表2 不同体积分数的乙醇对化合物H1～H4提取率的影响Table 2 Effect of extraction rate of compound H1—H4 with different volume fraction of ethanol

由表2可见,当φ(乙醇)=60%,70%,80%时,溶剂对化合物H1～H4的提取率相对较高且提取率相差较小,因此选择这3个体积分数的乙醇溶液作为提取溶剂进一步优化提取条件.

3.3 提取条件优化 在上述实验数据基础上,为确定回流提取的最优条件,本文通过正交试验(L933),考察乙醇的体积分数、V(液)∶m(料)和回流次数3个因素对急性子中化合物H1～H4提取率的影响. 试验因素与水平列于表3. 称取急性子粉末2.0 g,共9份. 按表3中列出的各项正交试验条件进行水浴回流提取,按2.1中色谱方法和条件,测定不同提取条件下提取物中化合物H1～H4的质量(mg)并计算提取率(提取率=(实测值/总质量)×100%),进一步筛选最佳提取条件. 实验结果列于表4和表5.

表3 (L933)正交试验因素水平Table 3 (L933)Levels of orthogonal test factors

表4 (L933)正交试验结果Table 4 (L933) Results of orthogonal test

由表5可见,本文考察的3种因素对总皂苷的提取率均影响较小,因此可采用直观分析法选择最佳提取工艺. A因素中KA2>KA1>KA3,故选择A2；B因素中KB1>KB2>KB3,故选择B1；C因素中KC3>KC2>KC1,故选择C3. 因此最佳提取工艺为A2B1C3,即：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,回流时间分别为60,45,30,30 min.

表5 正交试验结果方差分析*Table 5 Analysis of variance about the results

* F0.01(2,2)=99,F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9.

3.4 急性子总皂苷提取工艺的验证 称取急性子粉末100.0g,共3份,分别置于1 000mL圆底烧瓶中,按3.3中筛选的最优化提取条件回流提取,将提取液过滤,合并,减压浓缩,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至100mL容量瓶中,从中移取2mL,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54稀释并定容至10mL容量瓶中. 按2.1中色谱方法及条件,测定提取物中化合物H1～H4的质量比,并计算各化合物的提取率,结果列于表6.

表6 验证试验结果Table 6 Results of verified test

综上,本文通过正交试验优化得到的条件对总皂苷的提取率为98.19%,明显高于正交试验结果,最终确定急性子总皂苷最优提取条件为：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,提取时间分别为60,45,30,30 min.

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：第一部 [M]. 北京：化学工业出版社,2010：186.

[2] 宋立人,丁绪亮,藏载阳,等. 现代中药学大辞典 [M]. 北京: 人民卫生出版社,2001: 1583.

[3] MA You-yun. Clinical Application of SemenImpatientis[J]. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2007,41(1): 78. (马有运. 急性子临床应用举隅 [J]. 上海中医药杂志,2007,41(1): 78.)

[4] Shoji N,Umeyama A,Yoshikawa K. Baccharane Glycosides from the Seeds ofImpatiensbalsaminaL. [J]. Phytochemistry,1994,37(5): 1437-1441.

[5] CHEN Ming-xia,WANG Xiang-li,ZHANG Yu-jie. Study on the Oleaginous Constituents from the Seeds ofImpatiensbalsaminaL. and Their Toxicity [J]. China Journal of Chinese Materia Medica,2006,31(11): 928-929. (陈明霞,王相立,张玉杰. 中药急性子油类成分分析及毒性考察 [J]. 中国中药杂志,2006,31(11): 928-929.)

[6] PEI Hui. Studies of the Anti-tumor Activity Components and Determination of the Major Components onImpatientsBalsaminaL. [D]. Nanjing: Nanjing University of Chinese Medicine,2011. (裴慧. 急性子抗肿瘤活性成分与主要成分的含量测定 [D]. 南京: 南京中医药大学,2011.)

[7] MENG Lei. Studies on Chemical Component and Extraction Process from the Seeds ofImpatiensbalsaminaL. [D]. Changchun: Jilin University,2010. (孟磊. 急性子化学成分及提取工艺研究 [D]. 长春: 吉林大学,2010.)

[8] LI Xu-wen,MENG Lei,LI Qing-min,et al. Method of Total Hosenkosides Extraction from the Seeds ofImpatiensbalsaminaL.with Macroporous Adsorption Resin [J]. Journal of Jilin University: Science Edition,2011,49(5): 949-953. (李绪文,孟磊,李清民,等. 大孔吸附树脂法提取急性子总皂苷的方法 [J]. 吉林大学学报: 理学版,2011,49(5): 949-953.)

[9] TAN Li-na. Study on the Saponins from the Seeds ofImpatiensbalsaminaL. [D]. Changchun: Jilin University,2008. (谭丽娜. 急性子皂苷类成分的研究 [D]. 长春: 吉林大学,2008.)