匙羹藤提取物干预KKAy小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的实验研究＊

秦灵灵，徐暾海，桂海水，刘铜华△

(1.北京中医药大学东方医院，北京 100078;2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)

胰岛素抵抗不但是2型糖尿病发病的主要病理基础，同时又是多种代谢疾病发病的始发因素。近年来，以2型糖尿病、代谢综合症为代表的代谢性疾病发病率呈快速上升趋势，因此针对胰岛素抵抗的相关研究业已成为人们最为关注的热点问题。临床报道匙羹藤在对糖尿病的防治方面有明确的疗效，但是在实验研究方面多停滞在药效的验证层面，缺乏对其作用机制的深入研究。本研究从胰岛素抵抗为切入点，从分子水平探讨匙羹藤改善KKAy小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的可能机制，借以丰富匙羹藤抗糖尿病作用的科学内涵。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性6～7周龄，雄性KKAY小鼠18只，体质量26g±3g;同周龄雄性C57BL/6J小鼠9只，体质量22g±3g，购自中国医学科学院动物研究所(许可证号SCXK京2009-0004)。动物饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF实验室，动物室内设置12 h昼夜循环，并维持室温23℃ ±2℃，湿度55±10%。动物采用单笼喂养，期间自由摄食、饮水，KK鼠料购自于中国医学科学院动物研究所。

1.2 药物与试剂

匙羹藤提取物由北京中医药大学中药学院提供:匙羹藤生药饮片5kg，加水煎煮3次，料液比分别为 1∶10、1∶10、1∶8，煎煮时间分别为:1.5、1.5、1h，分别过滤合并滤液，滤液减压浓缩至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，过 80目筛，得匙羹藤提取物0.33kg;小鼠放免试剂盒(Merck millipore公司);血糖试纸(日本爱科来试剂公司);Trizol试剂盒(Invitrogen公司);PCR引物(生工生物工程上海有限公司);Real-time PCR扩增试剂盒(中原领先科技有限公司)

1.3 仪器

4℃低温高速离心机(美国Thermo公司);Real-Time PCR仪(美国 ABI 7500);核酸紫外分光光度计(德国Biophotometer公司);血糖仪(日本爱科来公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 KKAy雄性小鼠18只断尾取血，测随机血糖值≥13.9mmol/L者入选，18只全部入选。按照血糖随机分为模型组(DM)9只，匙羹藤提取物组(GS)9只，另取 9只雄性C57BL/6J小鼠作为空白对照组(NC)。每日GS组小鼠按照2.5g/kg灌胃给药共8周，DM组、NC组小鼠灌胃等体积无菌水。

1.4.2 观察指标及检测方法 (1)一般情况观察:观察小鼠毛色、神态、精神状态、活动度等情况，随时记录;(2)体质量:在给药周期内，各组小鼠于每周末禁食不禁水，8h后测量体质量;(3)空腹血糖、空腹血清胰岛素:在给药周期内，各组小鼠于每周末禁食不禁水，8h后剪尾采用血糖试纸测定血糖(7∶00～15∶00禁食);末次给药后小鼠禁食不禁水(00∶00～08∶00)，8h 后剪尾用试纸法测定空腹血糖;摘眼球取血后静置3h，3500r/min分离血清，采用放射免疫法测定空腹血清胰岛素水平;(4)胰岛素敏感指数(ISI)检测:采用李光伟法，ISI=1/(FPG×Fins)，取自然对数正态化后进行统计分析;(5)实时 荧 光 PCR 法 检 测 PPAR-γmRNA、PI3κ-p85 mRNA、CAPmRNA、GluT-4mRNA:处死各组小鼠，速取部分附睾脂肪垫，置入液氮中以备检测用。①总RNA提取:从液氮中取出脂肪组织放入预冷的研钵中，加入液氮进行快速研磨，采用Trizol一步法提取总RNA，采用核酸紫外分光光度计检测所获RNA浓度与纯度;②引物序列:PPAR γ上游引物:5’-GCCCTTTGGTGACTTTATGG-3’，下 游 引 物:5’-CTTCACGTTCAGCAAGCCT-3’，139bp;PI3κ-p85 上游引物:5’-GGGAGACATCTCAAGGGAAG-3’，下游引物:5’-TTTCCATCACGGTGAAAGATT-3’，162bp;CAP上游引物:5’-TCTTTCAGATCCTGCCTCAG-3’，下游引物:5’-TAGCATCCTTTGCCCTTCTC-3’，110bp;GluT4 上 游引 物:5’-ACTCATTCTTGG ACGGTTCC-3’，下 游 引 物:5’-TAGCTGTGCC CAGCATAGAC-3’，188bp;参照基因 GAPDH;上游引物:5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物:5’-CAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’，154bp;③RNA的体外反转与Real-Time PCR:经25μL反转录体系，42℃孵育60min，然后70℃10min，将所得的cDNA与下列物质加入20μL Real-Time PCR体系，94℃预变性 1min，94℃ 15s，60℃ 34s，72℃ 15s 40个循环，72℃ 10min，用相对定量 2－△△CT法分析结果;(6)统计学方法:应用SPSS 17.0统计软件处理数据，全部数据以均值±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态

模型组小鼠在给药过程中死亡1只，可能由于灌胃操作失败导致药液进入肺脏造成肺炎所致。在给药期内，NC组对照组小鼠精神状态良好，反应灵敏，活动自如，皮毛有光泽;DM小鼠精神萎靡，行为倦怠，反应迟钝，动作迟缓，皮毛干枯无光泽，随着实验时间的延长，这些情况逐渐加重;GS组与DM组小鼠状态类似，但是程度较轻，随着给药时间的延长精神状态有所好转。

2.2 匙羹藤提取物对KKAy小鼠体质量影响

表1显示，在给药过程中，DM组小鼠体质量明显高于NC组(P＜0.01)，与DM组比较，GS组体质量在第5周时出现降低(P＜0.05)，从第6周开始出现明显降低(P＜0.01)并持续到实验结束。

表1 各组KKAy小鼠体质量水平(±s)

表1 各组KKAy小鼠体质量水平(±s)

注:与NC比较:⊙P ＜0.01，与DM比较:#P ＜0.05，*P ＜0.01

组别 数量 2周 4周 5周 6周 8周2.24 28.10±2.67 DM 8 36.73±0.95⊙ 40.21±1.64⊙ 41.61±2.08⊙ 41.20±2.89⊙ 39.64±1.84⊙GS 9 35.99±1.62 38.80±1.73 38.39±1.54# 37.93±1.60* 36.22±1.59 NC 9 26.12±1.01 27.88±1.60 28.39±1.71 29.01±*

2.3 匙羹藤提取物对KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI的影响

在给药过程中，DM组小鼠FPG明显高于NC组(P＜0.01)，与DM组比较，GS组FPG在第6周时出现降低(P＜0.05)，从第7周开始出现明显降低(P＜0.01)并持续到实验结束。

表2显示，给药8周后，与NC组比较，DM组Fins水平明显升高(P＜0.01)，ISI明显降低(P＜0.01)，与 DM组比较，GS组 Fins水平降低(P＜0.05)，ISI升高(P ＜0.01)。

2.4 匙羹藤提取物对KKAy小鼠 脂肪组织PPAR-γmRNA 的影响

图1显示，药物干预8周后，DM组脂肪组织PPAR-γmRNA表达较NC组明显降低(0.47±0.14 vs 1.03±0.29，P＜0.01)，GS组较 DM 组明显升高(0.92±0.14 vs 0.47±0.14，P ＜0.01)。

表2 各组 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

表2 各组 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

注:与NC比较:⊙P ＜0.01，与DM比较:#P ＜0.05，*P ＜0.01

组别 数量 FPG(mmol/L)0.83±0.22 －1.61±0.27 DM 8 27.51±1.74⊙ 30.74±1.13⊙ 32.14±1.05⊙ 31.69±1.27⊙ 1.97±0.31⊙ －4.12±0.16⊙GS 9 27.24±2.03 29.59±1.46 30.94±1.32# 28.91±1.55* 1.52±0.47# －3.74±0.30 ISI NC 9 5.97±0.97 6.30±0.83 6.26±0.76 6.28±0.70 2周 4周 6周 8周Fins(ng/mL)8周*

图1 各组 KKAy小鼠脂肪组织 PPAR-γmRNA的表达量(±s)

2.5 匙羹藤提取物对KKAy小鼠 脂肪组织PI3κ-p85 mRNA 的影响

图2显示，药物干预8周后，DM组脂肪组织PI3κ-p85mRNA表达较NC组明显降低(0.48±0.10 vs 1.08±0.27，P ＜0.01)，GS组较 DM 组明显升高(0.68±0.07 vs 0.48±0.10，P ＜0.01)。

图2 各组 KKAy小鼠脂肪组织 PI3κ-p85mRNA的表达量(±s)

2.6 匙羹藤提取物对KKAy小鼠 脂肪组织CAPmRNA的影响

图3显示，药物干预8周后，DM组脂肪组织CAPmRNA表达较NC组明显降低(0.37±0.10 vs 1.02±0.27，P＜0.01)，GS组较 DM 组明显升高(0.79±0.20 vs 0.37±0.10，P ＜0.01)。

图3 各组 KKAy小鼠脂肪组织 CAPmRNA的表达量(±s)

2.7 匙羹藤提取物对KKAy小鼠 脂肪组织GluT-4mRNA的影响

图4显示，药物干预8周后，DM组脂肪组织GluT-4mRNA表达较NC组明显降低(0.26±0.07 vs 1.05±0.33，P ＜0.01)，GS组较 DM 组明显升高(0.63±0.09 vs 0.26±0.07，P ＜0.01)。

3 讨论

图4 各组KKAy小鼠脂肪组织GluT-4mRNA的表达量(±s)

匙羹藤主要分布于我国两广地区，是民间使用及临床报道具有治疗糖尿病作用的单味中药。动物实验也证实，其具有一定的降糖［1，2］以及降脂作用［3］。当前的研究结果显示，通过促进胰岛素分泌及合成，借以改善糖耐量是匙羹藤降糖作用的主要机制。胰岛素抵抗是在2型糖尿病发生发展中占有首要位置的病理因素，关于匙羹藤对于胰岛素抵抗方面的研究却很少，故本实验以胰岛素抵抗为研究切入点对其抗糖尿病的作用机制进行深入研究。

脂肪组织是胰岛素作用的外周靶组织，也是糖脂代谢进行以及交叉作用的主要场所，其中分布于脂肪细胞中对糖代谢和脂肪细胞分化均具有重要调节作用的PPAR-γ是当前研究IR的集中关注点，同时也是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶点。PPAR-γ具有高位调控作用，其可通过多个环节对IR具有改善作用，其中通过增加胰岛素介导GluT-4转运的受体后PI3κ以及Cb1-CAP信号通路中关键因子PI3κ-p85、CAP的转录水平，增加GluT-4基因表达量和葡萄糖的摄取率，改善胰岛素信号通路的传导，进而缓解IR是其最重要也是最直接的调控作用之一［4～7］。本实验以 PPARγ为研究初始点，以GluT-4表达量为有效性的评价标准以及作用的终点事件，观察脂肪组织中胰岛素介导GluT-4转运受体后信号通路中关键因子的变化，借以追踪干预药物作用机制的靶点路径。

采用与人类2型糖尿病病理基础相似的动物模型是进行研究的首要环节。KKAy小鼠是一种自发的2型糖尿病小鼠，具有肥胖、高血糖、血脂异常、高胰岛素血症等特征。该小鼠从8周起就开始出现IR，而具有IR特征的小鼠存在PI3κ信号通路传导障碍和GLUT4mRNA表达量减少等特征［8］，与本实验的研究思路相吻合，故选用此动物模型作为观察对象。

本实验结果显示，匙羹藤能够改善KKAy小鼠空腹血糖水平、空腹血清胰岛素以及胰岛素敏感指数，并推论其缓解胰岛素抵抗与其增加脂肪组织PPARγmRNA，进而增加被其调控的 PI3κ-p85、CAP基因转录水平，从而上调GluT-4mRNA水平、促进葡萄糖的摄取相关。但本实验并未观察PI3κ-GluT4以及Cb1-CAP-GluT4这两条信号通路中下游相关关键因子的变化，无法判断最后影响葡萄转运的是两条通路抑或是其中的一条，故应对其各自下游的磷酸肌醇依赖的蛋白激酶(PDK-1)、蛋白激酶B(PKB)以及磷酸化的PKB、AS160以及磷酸化的AS160、CrkⅡ蛋白、C3G蛋白、TC10等因子进行更深一步的研究。另外本实验对于分布于脂肪细胞膜表面的GluT4蛋白表达量未做观察，在以后的研究中将会应用蛋白免疫印迹法对分布于细胞膜的葡萄糖转运蛋白做定量评判，以便为评估葡萄糖转运率提供更为客观、直接的实验室指标。

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