脾气虚型HIV/AIDS患者淋巴细胞线粒体功能状态在常温和热应激条件下的改变情况＊

孙 萌，刘 颖，王克林，徐淑玲，孙 刚，王笑红，翟志光，杨凤珍，王 健△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2.中国中医科学院艾滋病防治研究中心，北京 100700)

近来大量研究表明，HIV病毒、炎性细胞因子以及高效抗病毒治疗药物等都会对HIV/AIDS患者免疫细胞线粒体功能产生不良影响。线粒体有“细胞的动力站”之称，这与中医脾为“气血生化之源”、“后天之本”有着密切联系。刘友章等认为，脾主运化更重要的是指食物在线粒体内的生物氧化过程，故其功能正常与否与细胞线粒体功能的完整有极密切的关系［1］。王健认为HIV/AIDS患者的中医证候以复合证为主，其中脾气虚证最多见［2］。

因此，本研究比较脾气虚证HIV/AIDS患者与健康人群淋巴细胞在37℃和40℃条件(模拟热应激)下，淋巴细胞线粒体膜电位(代表ATP合成能力，间接反应细胞能量代谢)差异，探讨HIV/AIDS患者脾气虚损病机的部分细胞免疫学基础，为中医药防治艾滋病提供理论支持和依据。

1 对象与方法

1.1 被试资料

健康人群来自中国中医科学院研究生院学生志愿者，阳性被试人群来自北京市地坛医院跟踪随访的北京市HIV/AIDS患者，经蛋白印记试验确认为HIV抗体阳性。HIV/AIDS患者分类按照美国疾病预防控制中心修订的HIV感染分类与CD4+T淋巴细胞计数分期方法。

1.2 调研方法

采用预先制定的“HIV/AIDS患者临床症状调查表”对患者进行详细询问。脾气虚证候诊断标准参照国家技术监督局1997年颁布的中华人民共和国国家标准《中医临床诊疗术语·证候部分》及《中医虚证辨证参考标准》、《艾滋病中药新药临床研究指导原则草案·内部参考》、《中医诊断学》等相关证候诊断标准，按照主证、次证及相应的选择条件进行统一辨证。筛选后确定健康被试者10名和脾气虚证HIV/AIDS患者30名，其中HIV/AIDS患者20名，AIDS患者10名。

1.3 CD4+T淋巴细胞计数和淋巴细胞线粒体膜电位检测

观察给药后患者CD4+T淋巴细胞的绝对计数和淋巴细胞线粒体膜电位检测。清晨采静脉血外周血2ml，将每人份全血按 1ml分为 2管，分别在37℃、40℃ 温度孵育1h，然后运用JC-1荧光染色法，在流式细胞仪上检测淋巴细胞早期凋亡信号——细胞内线粒体膜电位［1］。

1.4 统计学方法

组间比较用独立样本 t检验，相关分析为Pearson积差相关，P≤0.05为可接受的显著性水平。

2 结果

图1 常温(37℃孵育1h)及高热(40℃孵育1h)条件下健康人群和脾气虚HIV/AIDS患者淋巴细胞线粒体膜电位检测

图1显示，在37℃和40℃条件(模拟发热)下，本研究采用线粒体膜电位正常淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比(流式细胞仪检测图中Q2-1区黑色点代表线粒体膜电位正常淋巴细胞群)，反映个体淋巴细胞线粒体氧化磷酸化状态(代表ATP合成能力，间接反应细胞代谢和肌肉乏力指标)，结果发现健康对照人群和脾气虚证型HIV/AIDS患者感染者人群之间差异有统计学意义。图2显示，37℃条件下健康人群(n=10)线粒体膜电位正常淋巴细胞平均占总淋巴细胞的92.1±6.5%，40℃条件下健康人群(n=10)线粒体膜电位正常淋巴细胞平均占总淋巴细胞的95.8±4.5%。而常温37℃条件下气虚证型HIV/AIDS患者(n=30)线粒体膜电位正常淋巴细胞平均占总淋巴细胞的57.5±26.9%，40℃条件下气虚证型HIV/AIDS患者(n=30)线粒体膜电位正常淋巴细胞平均占总淋巴细胞的46.8±31.3%。脾气虚证型HIV/AIDS患者淋巴细胞线粒体氧化磷酸化状态比较健康对照组人群明显降低，在一定程度上说明免疫淋巴细胞能量代谢功能的下降是其气虚证型的本质所在。

图2 常温(37℃孵育1h)及高热(40℃孵育1h)不同温度条件下健康人群和脾气虚HIV/AIDS患者线粒体膜电位正常淋巴细胞百分比示意图

图3 不同水平CD4+T淋巴细胞数HIV/AIDS患者线粒体膜电位正常淋巴细胞百分比示意图

图3显示，以CD4+T淋巴细胞数是否小于每毫升全血350个为分组标准，将脾气虚证HIV/AIDS患者分为2组进行比较，尽管2组感染者之间的CD4+T淋巴细胞数差异有统计学意义，但2组淋巴细胞中线粒体膜电位正常百分比差异无统计学意义。通过 Pearson积差相关分析显示，脾气虚证HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞数与线粒体膜电位正常淋巴细胞百分比之间呈正相关，但差异无统计学意义(P≥0.05)。

3 讨论

从现代应激理论解释慢性消耗性疾病导致人体元气虚损的状态，其显著特征就是对生活中不可预知的应激适应能力的下降，如表现淋巴细胞凋亡易感性增高，在热应激以及氧化应激过程中生存能力下降而大量凋亡等［3］。本研究显示，健康人群淋巴细胞在40℃孵育条件下线粒体膜电位有上升趋势，说明在发热情况下健康人淋巴细胞的能量代谢上升，为应激提供能量储备;而HIV/AIDS患者淋巴细胞在40℃孵育条件下，线粒体功能有下降趋势，这也反映了患者在热应激条件下淋巴细胞能量代谢的下降，不足以应对发热情况下免疫激活的能量储备。另据文献报道，HIV/AIDS患者临床上出现频次最高的症状为发热约占80%，其次为乏力约占74%。脾气虚证HIV/AIDS患者在临床上最明显的症状之一就是乏力。本研究的结果发现，与健康人群比较脾气虚证HIV/AIDS患者淋巴细胞线粒体膜电位明显下降，特别是在体外模拟热应激条件下(40℃孵育1h)，反映了其机体在发热情况下能量代谢功能的下降，印证了脾气虚HIV/AIDS患者临床上出现的发热乏力等症状。

本研究还比较了不同水平CD4+T淋巴细胞数HIV/AIDS患者线粒体膜电位情况，发现脾气虚证HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞数与其淋巴细胞线粒体膜电位之间有一定的相关性，但相关性不显著。这与国外报道HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞的减少程度与淋巴细胞线粒体膜电位的降低呈显著性正相关有所不同。因为本研究只是在一个时间点横断面采集被试人群的资料和数据，还需要进行长期纵向跟踪研究才能得到更加全面的数据。

当前，改善HIV/AIDS患者免疫系统重建的研究工作已逐渐引起重视，但临床上评价中医药治疗HIV/AIDS疗效及其免疫系统功能的指标仍主要依据CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量，这存在很大的局限性，是亟待研究解决的问题之一。因为CD4+T淋巴细胞计数仅代表CD4+T淋巴细胞的数量，不能完全反映免疫系统的功能，更不能反映免疫细胞能量代谢水平;另一方面，病毒载量测定适用于评价HIV感染晚期HAART疗法的疗效，并不适合评价中医药治疗HIV/AIDS感染者的疗效［4］。目前现代医学对HIV/AIDS患者的治疗思路首先是针对病原体HIV病毒(如HAART疗法可以抑制HIV病毒的复制)，然而HAART疗法尽管能明显降低血浆病毒载量，但难以清除匿伏在细胞中的病毒，且对于无症状HIV感染者长期进行HAART疗法会直接损害其细胞线粒体功能，出现能量代谢紊乱等副作用。特别是最近几年研究表明，HIV病毒直接对CD4+T细胞的杀伤导致机体CD4+T细胞的下降，进而诱发AIDS的致病原理还有待商榷。HIV/AIDS患者免疫激活程度比血浆中病毒载量能够更好地预测疾病的发展进程。而传统中医学十分重视调节机体免疫功能，增强机体抵抗疾病的能力。研究发现，不少中医药能够改善免疫细胞的能量代谢以及双向调节机体的免疫功能［5］。因此本研究提出 HIV/AIDS患者脾气虚损病机，同时揭示其脾气虚病机的部分细胞免疫学基础，为中医药防治HIV/AIDS提供理论支持和依据，从而更好地指导中医临床，提高辨证论治疗效。

［1］侯丽颖，刘友章，贺松其，等.中医脾与线粒休功能的相关性探讨［J］.上海中医药杂志，2008，42(7):3-4.

［2］杨凤珍，刘颖，李洪娟，等.HIV/AIDS中医病因病机及证治规律研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2004，11(4):365-367.

［3］王玮文，邵枫，刘美，等.慢性应激对大鼠行为和免疫细胞热休克蛋白70表达的影响［J］.心理学报，2007，6:63-69.

［4］王克林.早期干预对降低中国艾滋病死亡率的意义［J］.公共卫生与预防医学，2006，17(5):118.

［5］Ko KM，Mak DH，Chiu PY and Poon MK.Pharmacological basis of Yang-invigoration’in Chinese medicine［J］.TRENDS in Pharmacological Sciences，2004，25(1):3-6.