黄芪葛根汤对2型糖尿病大鼠心肌病变的影响＊

陈艳芬，李卫民，高 英△，吴清和，唐春萍，杨超燕，陶曙红

(1.广东药学院中药学院，广州 510006;2.广州中医药大学中药学院，广州 510006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种独立于冠心病、高血压、先心病和其他类型心脏病之外的特异心脏病变，是导致糖尿病患者心衰的重要原因［1］，其病理改变主要表现为心肌细胞肥大、凋亡、灶性坏死和心肌间质纤维化。该病临床上很难早期发现，发病机制尚未完全明了，预防和治疗仍不完善，因此动物模型报道不多。临床和实验证明，黄芪、葛根单用或配伍应用对糖尿病心血管并发症有良好的疗效，而且这些中药也是临床用于治疗冠心病、心肌炎等心血管系统疾病的常用药物。因此，为了探讨糖尿病心肌病模型建立方法以及较全面地观察其病理改变，同时阐明黄芪葛根汤的作用，我们建立了具有高血糖、高血脂和胰岛素抵抗特征的2型糖尿病大鼠模型［2］。本研究主要从组织形态、超微结构、胶原纤维、细胞凋亡等多个角度观察大鼠心肌病理改变及药物的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级 SD雄性大鼠，体质量180～220g，购自广东省医学实验动物中心(合格证号粤监证字2008A020)，饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。

1.1.2 药物与试剂 黄芪葛根汤(HGD)浸膏每1g相当于生药1.71g;盐酸罗格列酮(Rsg)贵州圣济堂制药有限公司生产(批号20070502);链脲佐菌素(STZ)美国Sigma公司产品;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒德国罗氏公司产品。

1.1.3 主要仪器 日本NIKON E600显微镜，日本OLYMPUS BX51显微镜，日立H-600透射电镜。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分组与给药 大鼠先用高脂高热量饲料(高脂饲料由基础鼠料加酪蛋白、蔗糖、猪油等按比例组成，其中基础鼠料52%，酪蛋白12%，蔗糖10%，猪油24%，磷酸氢钙2%，复合多维0.1%，矿物质0.4%，盐0.2%)喂养4周，然后以STZ 30mg/kg腹腔注射，1周后取血测空腹血糖(FBG)和糖耐量。选择糖耐量异常(2hBG≥7.8mmol/L)的60只成模大鼠纳入实验。成模大鼠随机分成5组(模型组、Rsg组、HGD高、中、低剂量组)，继续以高脂饲料喂养8周。正常组10只大鼠一直采用基础饲料喂养。各组按体质量分别灌胃给药(10ml/kg)，每天1次，持续8周，正常组和模型组则给予等体积的蒸馏水。

1.2.2 标本采集与指标检测 实验结束当天经腹主动脉取血后处死各组动物，迅速开胸取出心脏，剪除包膜、血管，用冰生理盐水洗净，将小部分左心室切成1mm3小块，3%戊二醛迅速固定，4℃保存待做电镜标本;取部分心肌组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成4μm切片，分别供 HE染色、Masson染色和TUNEL实验用。

1.2.3 TUNEL检测心肌细胞凋亡 切片脱蜡至水，PBS洗3遍，50μL/mL蛋白酶 K处理，37℃20min;PBS洗3遍，3%H2O2-甲醇，室温封闭15min，PBS洗3遍，置4℃的0.1mol/L柠檬酸钠(内含0.1%TritonX-100)8min;PBS洗3遍，加 TdT标记Bio-dUTP(TdT标记反应混合液)，37℃孵育60min。PBS洗3遍，加入Protection kit-POD，37℃避光孵育30min;PBS洗3遍，DAB显色、水洗;苏木素复染、水洗，脱水、透明、封片。心肌细胞核(圆形或椭圆形)位于心肌细胞中央，其中凋亡细胞核棕黄色，正常细胞核蓝色。阴性对照细胞核全部蓝色，阳性对照细胞核全部呈棕黄色。每个标本随机选取10个高倍视野(×400)，用图像分析软件计数凋亡细胞核和正常细胞核，以凋亡细胞核与所有细胞核比值的平均值作为细胞凋亡指数。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行分析处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 HE染色观察心肌组织形态学

由图1可见，糖尿病大鼠成模8周后，模型组心肌细胞排列紊乱、疏松，心肌细胞肥大且严重变性，甚至空泡变，细胞核固缩、裂解，间质炎性细胞、成纤维细胞增生，心肌间质有胶原纤维沉积。HGD高、中剂量组心肌细胞基本排列整齐，部分病变区有心肌细胞肥大、变性，心肌间质少见胶原纤维沉积;低剂量组心肌细胞排列紊乱，有的细胞核固缩、裂解;Rsg组心肌细胞排列有些紊乱，肌纤维肿胀，部分心肌细胞肥大、变性;正常组心肌组织结构正常，细胞排列整齐、致密。

2.2 Masson染色观察心肌胶原纤维

正常组心肌细胞染成红色，胶原纤维蓝色，心肌胶原纤维分布均匀。图2显示，模型组心肌细胞间质、血管周围可见胶原成分堆积，分布不均匀，排列紊乱，相互连接成网状。各药物组心肌胶原纤维分布较均匀，HGD低剂量组稍差，心肌细胞间质、血管周围见少量胶原成分。采用Image ProPlus图像分析系统进行心肌组织胶原相对含量测定(见图3)，结果表明，与正常组比较模型组大鼠心肌组织胶原相对含量明显增加(P＜0.01);与模型组比较，HGD高、中、低剂量能不同程度减少心肌组织胶原相对含量(P＜0.01～P＜0.05)，提示该药可以明显抑制胶原纤维增生，Rsg组也能明显减少胶原相对含量(P ＜0.05)。

图1 各组大鼠心肌组织形态学改变(HE染色×100)Figure 1 Representative photomicrograph of myocardial tissue morphological changes，stained with hematoxylineosin( ×100).A:Control group，B:Diabetic model group，C:High-dose of HGD group，D:Middle-dose of HGD group，E:Low-dose of HGD group，F:Rosiglitazone group.

2.3 透射电镜观察心肌超微结构

正常组心肌细胞排列整齐，闰盘清晰、连续，结构完整。胞浆充满大量纵向平行排列的肌原纤维，形成明暗相间的肌节结构。胞浆中有丰富的线粒体，结构完整，嵴密集、排列有序且充满整个线粒体。模型组心肌细胞的肌原纤维排列紊乱、断裂、分离、局部溶解，闰盘扭曲模糊断裂，肌浆网扩张;核膜不完整并呈节段性溶解消失病变，异染色质凝聚;线粒体增多非常明显且呈堆积状，线粒体肿胀变性，嵴断裂、溶解，线粒体基质溶解、消失，形成多个空泡区;心肌细胞可见糖原颗粒和脂滴沉着，还可见到髓样小体。HGD高剂量组肌原纤维排列整齐，线粒体和细胞核形态正常，与正常组相似。中剂量组心肌超微结构也比较正常，低剂量组肌原纤维排列有紊乱现象，局部出现肌丝溶解、断裂病变，但较模型组有所改善。Rsg组肌原纤维排列基本整齐，线粒体和细胞核形态基本正常，个别有畸形与肿胀病变，心肌细胞可明显见到脂滴沉着(见图4)。

图2 各组大鼠心肌胶原纤维改变(Masson染色×200)Figure 2 Representative photomicrograph of myocardial collagen fibers change，stained with masson trichrome(×200)

图3 各组大鼠心肌胶原相对含量比较Figure3 Collagen relative contents through image analysis of masson trichrome.Control:Control group，Model:Diabetic model group，HGD-H:High-dose of HGD group，HGD-M:Middle-dose of HGD group，HGD-L:Low-dose of HGD group，Rsg:Rosiglitazone group.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P ＜0.01，*P＜0.05 vs model(±s，n=10)

2.4 TUNEL实验检测心肌细胞凋亡

实验结果显示，糖尿病心肌病变模型组大鼠阳性细胞远远多于正常对照组(P＜0.01)，说明模型组心肌细胞存在凋亡增加现象。药物干预后有不同程度凋亡细胞的表达，HGD高剂量、中剂量组、Rsg组的凋亡指数与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，HGD低剂量组的阳性表达高于其他药物组(见图5、图6)。

3 讨论

图4 各组大鼠心肌超微结构改变Figure4 Myocardial ultrastructural changes in rats observed by transmission electron microscopy.

糖尿病心肌病变于1974年由Hamby等首先提出，其作为糖尿病的一种独特的心脏并发症目前已得到公认，其主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡、坏死，肌丝纤维大量丢失，心肌细胞外间质有不溶性胶原蛋白积聚和纤维化［3，4］，这种结构方面的病变将导致心肌收缩和舒张功能降低，易并发心力衰竭及心律失常。本病属中医消渴并发“心悸”、“胸痹”范畴，常以益气养阴为基本治疗原则。黄芪、葛根为中医临床常用药对，二者对糖尿病、心血管疾病均有良好疗效，许多中成药玉泉丸、消渴丸、天芪降糖胶囊等都含有此药对。黄芪葛根汤源自《证治汇补》，方中葛根甘凉生津止渴，升脾中清阳，输津液以溉五脏而滋阴清热。黄芪甘温益气健脾，取其气复津还之意，二者相配益气养阴、生津止渴，古今用于糖尿病及其并发症的治疗。

本研究采用HE染色观察大鼠一般组织形态学改变，结果发现与正常组比较，模型组在组织形态学方面发生明显的心肌病理改变，即心肌细胞排列紊乱、疏松，心肌细胞肥大、严重变性，成纤维细胞增生，心肌间质胶原纤维增生。而HGD各剂量组不同程度抑制这种心肌病变，尤其是高、中剂量心肌细胞基本排列整齐，仅部分病变区有心肌细胞肥大、变性，心肌间质少见胶原纤维沉积。进一步采用Masson三色染色并进行图像分析，结果发现模型组心肌细胞间质胶原明显增生且分布不均匀、排列紊乱，相互连接成网状，而HGD能显著减轻心肌纤维化病变。这个结果通过进一步的心肌羟脯氨酸含量测定得到证实［5］。

图5 各组大鼠心肌细胞凋亡情况(TUNEL×400)Figure 5 Cardiomyocyte apoptosis defected by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)method(×400)

图6 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较Figure 6 Apoptotic index of cardiomyocyte defected by TUNEL method.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P＜0.01 vs model.(±s，n=10)

细胞学病变是糖尿病心肌病的一种重要病变。本研究观察到，糖尿病模型组心肌细胞的肌原纤维排列紊乱并呈波浪状改变，或断裂、分离、局部溶解，闰盘扭曲模糊断裂，肌浆网扩张。特别是线粒体增多非常明显，呈堆积状，线粒体肿胀变性，基质溶解、消失并形成多个空泡区，心肌细胞内见到髓样小体。以上说明糖尿病大鼠心肌细胞明显受到损伤，由于糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱出现“葡萄糖毒性”，导致心肌酶活性降低，有氧代谢不能顺利进行，能量产生障碍，因此与能量代谢密切相关的线粒体病变较为明显，表现在数量代偿增多，发生肿胀、变性、嵴断裂等改变。实验结果还证实，HGD高、中剂量能明显抑制这种心肌的超微结构改变，在肌原纤维、线粒体、细胞核等各个方面的表现都明显优于模型组。

心肌细胞凋亡在各种心脏疾病的发病机制中都起着重要的作用［6，7］，过度的心肌细胞凋亡将导致心肌缺血、心力衰竭等病变。国内外众多研究表明，糖尿病心肌病心肌细胞存在凋亡现象［8］，主要是因为高血糖时氧化应激增加，信号传导路径改变，导致基因表达异常，激活细胞程序化死亡，灶性坏死以及坏死区被纤维组织取代形成瘢痕，同时凋亡也可以导致细胞内活性氧增多，而心肌细胞间质纤维沉积及纤维化是糖尿病心肌病的另一重要因素。本研究利用TUNEL实验测得糖尿病大鼠心肌细胞凋亡指数较正常对照组高，而HGD高、中剂量能显著降低凋亡指数，提示该药可以通过干扰心肌细胞凋亡程序而保护心肌，其机理有待于进一步的研究。

综上所述，本研究建立的大鼠糖尿病心肌病变模型具有心肌细胞肥大、凋亡、坏死，心肌间质纤维化的典型心肌病病理特征，因此采用这种造模方法能复制与临床发病机制接近的糖尿病心肌病变模型。黄芪葛根汤从宏观的组织形态和微观的超微结构都能明显地防止或延缓糖尿病心肌病变的发生发展。罗格列酮是临床常用的胰岛素增敏剂，国内外也有文献报道该药可以用于治疗糖尿病心血管并发症的治疗。我们的研究证实，该药能显著改善胰岛素抵抗且具有一定的心肌保护作用，但在改善心肌病理形态学的长效作用方面可能略显不足。

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