间充质干细胞移植对EAE小鼠Treg细胞功能的影响

刘萍萍 李倩如 朱敬松 轩小燕 管莎莎 杜 英

(郑州大学基础医学院微生物与免疫教研室，郑州450001)

实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelintis，EAE)是一种主要由T细胞介导的，以中枢神经系统脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明 EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性 T细胞(regulatory T cell，Treg)细胞数量和免疫抑制功能均降低，给EAE小鼠输入功能性Treg能改善其病理状况[2，3]。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)是骨髓中除造血干细胞外的另一种成体干细胞，具有强大的自我更新和多向分化能力，能分化成多种组织细胞，如神经细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，并且MSCs具有显著的免疫调节活性，能抑制T细胞、B细胞和NK细胞增殖，能诱导产生 Treg[4-7]。本研究旨在通过观察MSCs移植EAE小鼠前后体内免疫器官中Treg数量及功能的变化，探讨 MSCs移植在治疗EAE小鼠中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂 SPF级雌性C57BL/6J小鼠70只，6～8周龄，体重(20±2)g，购自郑州大学实验动物中心。MOG多肽由联美生物科技有限公司合成，结核菌素购自美国DIFCO公司，百日咳毒素购自中国药品生物制品检定所，不完全弗氏佐剂(IFA)购自Sigma公司，抗小鼠荧光标记单抗:PE-Foxp3、FITC-CD4、APC-CD25 及同型对照，antimouse CD28、anti-mouse CD3均购自美国 eBioscience公司，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒购自TaKara公司，CD4+CD25+细胞免疫磁珠分选试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司。

1.2 EAE模型的建立 60只C57BL/6J小鼠，随机分为EAE模型组、EAE模型MSCs移植组、正常对照组，每组20只。EAE模型组及EAE模型MSCs移植组自小鼠腋下至尾部皮下多点注射免疫乳剂100 μl，免疫乳剂含 MOG 50 μg、结核菌素 500 μg、不完全弗氏佐剂50 μl。分别于致敏第2天、第4天，小鼠腹部皮下注射百日咳毒素200 ng。致敏第7天再次注射免疫乳剂。致敏后小鼠常规饲养。

1.3 小鼠神经功能评分 EAE诱导后，每日观察小鼠症状、体征和体重变化，参照Kono等的评分标准进行神经功能评分:0分为无症状，1分为出现尾巴无力，2分为尾部和后肢无力，3分为后肢瘫痪，4分为后肢瘫痪加前肢无力，5分为濒死状态或死亡。免疫原致敏14～20天，凡评分≥1分者可作为EAE模型。

1.4 骨髓MSCs的分离和培养 无菌分离正常C57BL/6J小鼠股骨和胫骨，暴露骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，将收集的细胞液经200目不锈钢网过滤，1 000 r/min离心15分钟收集细胞，红细胞裂解液裂解红细胞，用含10%胎牛血清和20 ng/ml bFGF的DMEM培养液重悬细胞，细胞浓度调至5×105ml-1，置37℃、5%CO2培养。24小时后去除未贴壁的细胞，将贴壁细胞继续培养，每日观察细胞生长情况，待细胞融合至贴满瓶壁的80%以上，用胰蛋白酶-EDTA液进行消化，传代。利用MTT法检测细胞生长状况。

1.5 MSCs的移植 将培养的MSCs经胰酶消化，PBS离心洗涤3次，加入PBS重悬细胞后，调整细胞浓度为1×106ml-1，经小鼠尾静脉注射EAE模型MSCs移植组(每只0.2 ml)，共2次，间隔2天。正常对照组及EAE模型组小鼠尾静脉注射0.2 ml PBS。

1.6 流式细胞术分析Treg的数量 在MSCs移植后第20、40、60天，随机处死各组小鼠5只，分别无菌获取胸腺、脾脏、淋巴结，通过机械研磨、裂解红细胞后，PBS洗3次，制成单个核细胞悬液。加入FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3 抗小鼠 mAb及同型对照抗体三标记细胞，流式细胞仪FACSCalibur(BD公司)检测。

1.7 Real time RT-PCR法检测Foxp3和相关细胞因子mRNA表达 MSCs移植后分别于第20、40、60天获取小鼠脾脏和淋巴结，加入Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，用RT Kit(Takara公司)反转录成 cDNA，用 SYBR green I real time PCR Kit(TaKaRa公司)试剂盒扩增目的基因，引物由上海生工合成，FoxP3:sence 5'agg aga aag cgg ata cca 3'，anti-sence 5'tgt gag gac tac cga gcc 3';IL-10 sence 5'ttt caa aca aag gac cag 3'，anti-sence 5'gga tca ttt ccg ata agg 3';TGF-β1:sence 5'cta atg gtg gac cgc aac aac g 3'，anti-sence 5'gca ctg ctt ccc gaa tgt ctg 3';IL-4:sence 5'tcc tgc tct tct ttc tcg 3'，anti-sence 5'ttc tcc tgt gac ctc gtt3';GAPDH(内参照):sence 5'gtt gtc tcc tgc gac ttc a 3'，anti-sence 5'ggt ggt cca ggg ttt ctt a 3'。

1.8 检测Treg对CD4+CD25-T细胞(Teff)增殖的抑制作用 免疫磁珠法分选各组小鼠脾脏CD4+CD25+及CD4+CD25-细胞，分选方法参照免疫磁珠分选试剂盒说明书。用CD3单抗包被96孔培养板，先将正常对照组小鼠的CD4+CD25-细胞重悬到含10%胎牛血清、100 U/ml IL-2、1 μg/ml CD28 mAb的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为1×106ml-1，取100 μl加入到各包被孔中，然后分别加入正常对照组、EAE组、EAE模型 MSCs移植组的CD4+CD25+细胞各100 μl(细胞浓度1 ×106ml-1)，每组设3个复孔，置5%CO2饱和湿度37℃培养24小时。MTT法检测各组细胞的增殖情况。

2 结果

2.1 MSCs体外培养、增殖特征 初分离的骨髓单个核细胞在倒置显微镜下呈现为小球形，诱导培养3～4天后部分细胞贴附于培养瓶壁，形状似纺锤形，有较强折光性。培养至7～10天，绝大多数细胞贴附于瓶壁，并逐渐生长形成分散的或条索状聚集状态，细胞体积显著增大。继续传代培养，通过MTT法检测MSCs增殖活性，显示第4、5代细胞增殖能力最强，随传代次数增加，MSCs增殖能力逐渐减弱，并出现细胞内颗粒、细胞碎片等老化现象，因此利用传4～5代的MSCs进行细胞移植，见图1。

2.2 MSCs移植对EAE小鼠神经功能评分的影响MSCs移植前，EAE模型组、EAE模型MSCs移植组小鼠于EAE诱导14天均出现显著异常表现，85%EAE诱导小鼠出现神经功能评分增加，达到2分以上，部分小鼠出现尾部瘫痪、弓背，部分小鼠表现为后肢无力、甚至瘫痪。MSCs移植后，EAE模型MSCs移植组小鼠神经功能评分显著降低，神经功能持续改善，与EAE对照组相比有显著差异，P＜0.05，见表1。

2.3 各组小鼠脾脏、淋巴结、胸腺 CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量 流式细胞术检测结果显示，MSCs移植后第20天，EAE模型MSCs移植组和正常对照组胸腺、脾脏和淋巴结中的 CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例均显著高于EAE模型组(P＜0.05)，见图2。

2.4 各组小鼠淋巴器官 Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA的水平 RT-PCR检测结果显示Foxp3在正常对照组胸腺、脾脏和淋巴结稳定表达，EAE模型组小鼠各淋巴器官Foxp3 mRNA水平逐渐降低，与正常对照组相比有显著差异，P＜0.05。EAE模型MSCs移植组在MSCs移植前胸腺、脾脏和淋巴结Foxp3 mRNA呈现低表达，MSCs移植20天后，逐渐升高，IL-10、TGF-β1 mRNA 水平亦逐渐升高，移植后第50天，上述细胞因子mRNA水平均与EAE模型组相比有显著差异，P＜0.05(见表2，图3)。

图1 体外培养传代MSCs形态(×200)Fig．1 Themorphology of MSCs subcultured in vitro(×200)

表1 MSCs移植对EAE小鼠神经功能评分的影响(n=20)Tab．1 The influence of MSCs transplantation on clinical score of EAE mice(n=20)

图2 MSCs移植对小鼠脾脏、淋巴结、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量的影响Fig．2 The effection of MSCs transplantation on the frequency of CD4+CD25+Foxp3+T in spleen，lymph node and thymus of mice

图3 MSCs移植对各组小鼠淋巴器官Foxp3、TGF-β、IL-10 mRNA水平的影响Fig．3 The influence of MSCs transplantation on the mRNA level of Foxp3，TGF-β and IL-10 in lymph organs of mice

表2 MSCs移植后50天各组细胞因子mRNA水平(±s)Tab．2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

表2 MSCs移植后50天各组细胞因子mRNA水平(±s)Tab．2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

Note:Compared with EAE mice，1)P ＜0.05.

Group.35 6.52±0.42 EAE mice with MSCs 5.24±0.181)14.88±0.281)14.26±0.351)6.42±0.271)9.12±0.351)14.45±0.411)8.02±0.351)12.54±0.401)10.84±0.371)1 IL-10 EAE mice 3.01±0.21 11.56±0.26 11.23±0.32 4.35±0.21 4.67±0.34 8.46±0.41 5.23±0.38 8.74±0 Thymus Spleen Lymph node Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β 3 13.12±0.39 10.05±0.29 Normal control 6.14±0.16 15.26±0.19 15.46±0.33 6.74±0.17 8.71±0.32 10.23±0.52 8.06±0.3

图4 CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-Teff增殖的抑制作用Fig．4 The suppression of CD4+CD25+Treg on the proliferation of CD4+CD25-Teff

2.5 Treg对Teff增殖的抑制作用 与正常对照组相比，EAE组小鼠Treg对Teff增殖的抑制作用显著降低，P＜0.05，MSCs移植组Treg对Teff增殖作用显著增强，与EAE组相比有显著差异，P＜0.05，见图4。

3 讨论

EAE的临床表现、病理特征及免疫异常等均与MS相似，故被作为研究MS发病机制和治疗策略的动物模型。MS和EAE中枢神经系统的脱髓鞘病变与效应性T细胞过度活化、炎症细胞在CNS浸润、前炎症细胞因子和介质的产生高度相关[8]。

Treg是体内一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，其数量减少或功能缺失可导致多种自身免疫病的发生[9]。Foxp3被认为是Treg的重要标志，是Treg发育和发挥功能的关键因素，可能影响Treg的发育及其免疫调节过程[10]。Treg与效应细胞之间的相互接触也可通过Treg分泌的细胞因子IL-10、TGF-β实现。有研究表明去除Treg的小鼠易发生EAE，过继转移Treg细胞则有助于预防EAE的发生[11]。本研究结果显示，MOG诱导的EAE小鼠模型，伴有胸腺、脾脏、淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例减少、Foxp3表达降低，说明Foxp3 mRNA表达水平降低直接影响CD4+CD25+Foxp3+Treg在胸腺和脾脏、淋巴结的数量，且与免疫功能紊乱相关，与EAE的发生有关。

已有大量实验证实EAE小鼠通过输入MSCs其临床症状明显减轻，中枢神经系统炎症病灶及脱髓鞘程度均降低[12，13]，移植的 MSCs可以在 EAE 小鼠淋巴结被发现，认为MSCs是通过抑制CD4+Th1细胞而起作用。本研究发现同基因MSCs移植能使MOG免疫的EAE小鼠症状好转、神经功能评分降低，提示MSCs移植能显著改善EAE临床进程，与文献报道结果一致。在临床评分降低的同时，MSCs移植还能使EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例增加，脾脏、淋巴结、胸腺Foxp3 mRNA表达上调。提示MSCs移植治疗EAE的机制可能通过诱导Foxp3 mRNA表达增加和CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量增加有关。

已有数据表明，MSCs能通过产生TGF-β和IL-10发挥免疫抑制活性，Foxp3与Treg介导的免疫抑制调节作用通过诱导 TGF-β和 IL-10的产生有关[14，15]。本研究结果显示，EAE 组 Foxp3 mRNA 的表达在上述各器官的表达量显著低于正常对照组，当EAE组分别给予同基因MSCs移植后，Foxp3 mRNA表达比EAE组显著增加。提示MSCs移植能诱导Foxp3 mRNA的表达。同时，TGF-β1 mRNA和IL-10 mRNA表达在MSCs移植组也比EAE组显著增加，说明MSCs移植也能改变TGF-β1、IL-10的表达。MSCs移植后，Foxp3、TGF-β1和 IL-10 mRNA在胸腺、脾脏、淋巴结表达的增加，并且Treg对Teff增殖的抑制活性得以恢复，MSCs可能通过这些机制发挥其免疫调节活性，改变EAE临床进程。

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