rDNA-ITS2序列作为中国按蚊分子鉴别特征的评述：Ⅰ按蚊亚属*

伍 桐 马雅军

(1. 第二军医大学基础医学部病原生物学教研室，上海 200433；2.第二军医大学研究生管理大队，上海 200433)

许多传病按蚊属于种团或复合体的成员，中国的赫坎按蚊种团(Anopheleshyrcanusgroup)、微小按蚊种团(An.minimusgroup)和大劣按蚊复合体(An.diruscomplex)即是典型的例子，其成员种仅依据成蚊形态特征较难准确区分(陆宝麟等，1997)。对于按蚊种团或复合体隐种的鉴别研究始于上世纪20年代，从比较虫卵特征、吸血习性和交配的不相容性开始，到观察染色体核型等，发现了一些生态的、行为的、生化的和分子生物学的特征均为按蚊隐种鉴别提供了有益的证据。

业已证明，在用于蚊种鉴别的分子标志中，核糖体DNA第2内转录间隔区(Ribosomal DNA second internal transcribed spacer，rDNA-ITS2)序列特征是较为理想的标志(Collinsetal., 1996)，但也发现在近期分化的隐种间，其差异非常小，如冈比亚按蚊An.gambiae复合体的ITS2差异范围为0.4%～1.6%(Paskewitzetal., 1994)，较难应用。迄今，愈来愈多的蚊种ITS2序列被注册到GenBank数据库，笔者在整理和分析中国按蚊属蚊种已注册ITS2序列的基础上，对其在鉴别中的应用价值进行评述。因数据量较大，笔者将分为按蚊亚属和塞蚊亚属2个部分进行报告。

1 材料与方法

1.1 rDNA-ITS2序列信息

在GenBank数据库中，以中国按蚊亚属蚊种名为关键词，搜索获得所有登记的ITS2序列，进行统计和整理。

1.2 序列分析方法

将下载的所有序列，首先采用Clustal X软件包进行对齐和比对分析，之后转化为MEGA 5可识别文件，计算序列在种内与种间的差异性(p-distance)。

2 结果

2.1 ITS2序列信息

截止2012年10月，GenBank中注册的中国按蚊亚属蚊种的ITS2序列共584条，隶属20种(包括同物异名)、待定种5种和杂交种1个(表1)。

表1 中国按蚊亚属蚊种在GenBank中的rDNA-ITS2序列信息(截止2012年10月)Tab.1 Nucleotide sequences of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes in the GenBank (by Oct. 2012)

续表1Tab.1continued

种类Species序列样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References韩国Korea KLEK01GU384713-GU384716Joshi et al., 2010韩国KoreaDQ177501直接提交Direct submission韩国KoreaAY753740Li et al. 2005朝鲜按蚊An. koreicus中国ChinaAY523635Ma and Xu, 2005韩国KoreaDQ177500直接提交Direct submission贵阳按蚊An. kweiyangensis中国ChinaAF261150Ma and Xu, 2005昆明按蚊An. kunmingensis中国China KM1/AKM3AY170920Ma and Xu, 2005雷氏按蚊An. lesteri韩国KoreaEU789791Park et al., 2008a韩国KoreaGU384717-GU384722Joshi et al., 2010韩国KoreaAY375468-AY375469Wilkerson et al., 2003韩国KoreaDQ177502直接提交Direct submission中国ChinaAF384172Ma and Xu, 2005中国ChinaAY803792-AY803801Ma and Xu, 2005中国ChinaAJ004941.2马雅军等, 1998; 马雅军等, 2002; Ma and Xu, 2005韩国KoreaAJ620899-AJ620902Hwang, 2007日本JapanAB159606直接提交Direct submission凉山按蚊An. liangshanensis中国China KM2/AKM4AY170922Ma and Xu, 2005中国ChinaAF146750Ma and Xu, 2005林氏按蚊An. lindesayi 韩国Korea sub_species ja-ponicusAJ620898直接提交Direct submission韩国Korea sub_species ja-ponicusDQ398773Sames et al., 2008中国ChinaJX944708直接提交Direct submission米赛按蚊An. messeae俄罗斯Russia M-35species BHE659702直接提交Direct submission俄罗斯Russia M-50species AHE659703直接提交Direct submission俄罗斯Russia N-6species BHE659704直接提交Direct submission俄罗斯Russia Ch-1species AHE659705直接提交Direct submission俄罗斯Russia Ch-2species BHE659706直接提交Direct submission俄罗斯Russia A-1 species AHE659707直接提交Direct submission俄罗斯Russia A-22species BHE659708直接提交Direct submission英国Russia 3594NHMEF090193直接提交Direct submission瑞典SwedenEF090194-EF090196直接提交Direct submission罗马尼亚Romania RO18-86NHMEF090197直接提交Direct submission罗马尼亚RomaniaAY648982-AY648998直接提交Direct submission英国EnglandAY238412Di Luca et al., 2004荷兰HolandAY238413Di Luca et al., 2004意大利ItalyAY238414-AY238419.2Di Luca et al., 2004黑山MontenegroAY238420.3Di Luca et al., 2004南斯拉夫YugoslaviaAY238421.4Di Luca et al., 2004哈萨克斯坦KazakhstanAY238422Di Luca et al., 2004俄罗斯RussiaFN646200-FN646219直接提交Direct submission德国、意大利、奥地利Germa-ny, Italy, AustriaAY365011Proft et al., 1999英国EnglandAF452699-AF452700直接提交Direct submission英国EnglandAF504197-AF504236直接提交Direct submission希腊GreeceAF342711-AF342712Linton et al., 2001伊朗IranAY050639直接提交Direct submission俄罗斯Russia 4kAM409762-AM409776直接提交Direct submission俄罗斯Russia 8xyAM409782-AM409799直接提交Direct submission哈萨克斯坦Kazakhstan DbAa20AJ783400直接提交Direct submission意大利Italy mesRI-AZ50105Marinucci et al., 1999中国ChinaAF305556马雅军等, 2001带足按蚊An. peditaeniatus泰国ThailandAB539056-AB539063Choochote, 2011泰国ThailandHM488269-HM488271Paredes-Esquivel et al., 2011中国ChinaAY129958Ma and Xu, 2005

续表1Tab.1continued

种类Species序列样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References中国ChinaAF543862Gao et al., 2004暗灰按蚊An. pullus韩国KoreaEU789792Park et al., 2008a中国ChinaJN865246-JN865249周晓俊等, 2011韩国Korea Form AAY444345Park et al., 2003韩国Korea Form BAY444346Park et al., 2003韩国KoreaGU384701-GU384706Joshi et al., 2010韩国KoreaAY170923-AY170924Ma and Xu, 2005韩国KoreaAF146749Ma and Xu, 2005韩国KoreaAY375470-AY375471Wilkerson et al., 2003韩国KoreaDQ177503直接提交Direct submission萨氏按蚊An. sacharovi伊朗IranAY114204-AY114211Sedaghat et al., 2003a, 2003b土耳其TurkeyAY238395Di Luca et al., 2004亚美尼亚ArmeniaAY238396-AY238399Di Luca et al., 2004阿塞拜疆AzerbaijanAY238400-AY238404Di Luca et al., 2004伊朗IranAY238405Di Luca et al., 2004希腊GreeceAF466745-AF466748直接提交Direct submission希腊GreeceAF485805-AF485810直接提交Direct submission希腊GreeceAF462077-AF462143直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 10-6FN665793直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 2-1FN665795直接提交Direct submission伊朗Iran NHM11434FJ210878Azari-Hamidian et al., 2009伊朗IranFJ210888-FJ210891Azari-Hamidian et al., 2009伊拉克IraqEU346646-EU346655直接提交Direct submission伊朗Iran Tg23DQ662410直接提交Direct submission伊朗IranDQ243825-DQ243828Djadid et al., 2007伊朗IranDQ243832-DQ243833Djadid et al., 2007伊朗Iran D13TAFAY842515Djadid et al., 2007伊朗Iran D9TAFAY842517Djadid et al., 2007希腊Greece 2586NHMAF469854直接提交Direct submission阿塞拜疆AzerbaijanAY100456直接提交Direct submission-AY365012Proft et al., 1999伊朗Iran AZ3103AF436062直接提交Direct submission土耳其TurkeyFN565570-FN565575直接提交Direct submission俄罗斯RussiaAM269899直接提交Direct submission伊朗Iran S120AY533852直接提交Direct submission意大利Italy sactu-A1Z83198.2Marinucci et al., 1999中华按蚊An. sinensis日本Japan Form AEU931611-EU931612Park et al., 2008a日本Japan Form BEU931613-EU931614Park et al., 2008a日本JapanAB159603直接提交Direct submission韩国KoreaEU789790Park et al., 2008b泰国ThailandHM488258-HM488259Paredes-Esquivel et al., 2011韩国KoreaGU384691-GU384696Joshi et al., 2010日本Japan SINJ01GU384697Joshi et al., 2010泰国Thailand SINT01GU384698-GU384699Joshi et al., 2010中国China SINC01GU384700Joshi et al., 2010韩国Korea Form BAY130469-AY130471Min et al., 2002泰国Thailand Form AAY130472-AY130473Min et al., 2002韩国KoreaWCKR_2AY130474Min et al., 2002韩国KoreaDQ177504直接提交Direct submission韩国Korea 1AY375464Wilkerson et al., 2003韩国Korea 1AY339278Hwang et al., 2006中国ChinaAF543861Gao et al., 2004中国China SMMU-SZGQ161923马颖等, 2009中国China 2AY375465Wilkerson et al., 2003

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种类Species序列样本信息Sequence featureGenBank登记号Accession number文献References中国ChinaAY316154-AY316155Ma and Xu, 2005中国ChinaAY316156Ma and Xu, 2005中国ChinaAJ004942马雅军等, 1998; 马雅军等, 2002; Ma and Xu, 2005拟中华按蚊An. sineroides韩国KoreaEU789795Park et al., 2008a韩国KoreaGU384723-GU384725Joshi et al., 2010韩国KoreaDQ177505直接提交Direct submission韩国KoreaAJ620895直接提交Direct submission日本JapanAB159605直接提交Direct submission八代按蚊An. yatsushiroensis中国ChinaAY186791-AY186792Ma and Xu, 2005中国China YASCAY170925Ma and Xu, 20052An. sp.YM-2003a中国ChinaAY306128Ma and Xu, 2005#2An. hyrcanus group 泰国Thailand TR6HM488268Paredes-Esquivel et al., 2011An. sp.3.CPE-2010泰国Thailand TR3HM488272-HM488267Paredes-Esquivel et al., 20112An. hyrcanus group An. sp.LL1中国ChinaJX944687-JX944703直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL2中国ChinaJX944704直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL3中国ChinaJX944705-JX944707直接提交Direct submission3An. kleini×An. sinensis 韩国KoreaGQ265915-GQ265916Joshi et al., 2009

注：1同物异名An.lesteri, synonym ofAn.lesteri;2尚未订名的种类, unnamed species;3杂交种, hybride; - 无测序样本信息, no information of sequenced sample;§原文中为待定种An. sp. 2；The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 2;#原文中为待定种An. sp. 1, The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 1.

2.2 ITS2序列在种内的差异

2.2.1中华按蚊: 已注册ITS2序列的中华按蚊样本来源于中国、日本、韩国和泰国，样本信息描述包括中华按蚊A型和B型(Form)，此型是据染色体核型不同而确定(Baimaietal., 1993)，有学者纯化培养了来自泰国和日本的中华按蚊两型，以及韩国的B型，分别在实验室杂交，结果显示杂交的子代可育(Parketal., 2008b)。笔者比对了所有注册的中华按蚊ITS2序列，结果显示其间差异小于1%，泰国的中华按蚊A型(AY130472-AY130473)与其他序列间存在3处固定变异，而日本的中华按蚊A型(EU931611-EU931612)却未见上述改变，提示中华按蚊的两型目前在ITS2序列水平尚无法区分。

2.2.2八代按蚊与暗灰按蚊: 八代按蚊与暗灰按蚊的序列均由韩国和中国的学者注册，有学者认为在韩国分布的八代按蚊是暗灰按蚊同物异名(Shinetal.，2001)，但因未与模式产地(日本Yatsushiro Kyushu)和中国的标本进行比较，故笔者将采自中国的样本仍沿用八代按蚊的学名。

在已注册ITS2序列的暗灰按蚊中，部分样本信息描述为A型和B型，其差异仅表现在形态特征、生态习性和染色体核型，实验室杂交能产生可育后代(Parketal., 2003)。将所有暗灰按蚊与八代按蚊的ITS2序列进行比对，发现除2条序列存在双碱基突变外(JN865249和GU384702)，其他序列间的差异均显现在2处兼并碱基位点，差异性小于0.5%。

2.2.3雷氏按蚊与嗜人按蚊: 雷氏按蚊与嗜人按蚊的分类地位经多次反复修订，现已公认嗜人按蚊是雷氏按蚊的同物异名(瞿逢伊，2008)，但在GenBank数据库中仍存在未更新的嗜人按蚊ITS2序列(AJ620897)。已注册ITS2序列的雷氏按蚊样本来自韩国、中国和日本，比对后发现来自韩国样本的4条序列(AJ620899-AJ620902)与其他序列间的差异大于8%(Hwang，2007)，故比对时需谨慎，剩余的序列间差异小于0.9%。

笔者早前文章中报告的“雷氏按蚊”(马雅军等，2000；Maetal., 2000; 马雅军等，2002)，在后续的研究中，发现鉴定有误，即以“待定种”代表(Maetal., 2005; 瞿逢伊，2005)，后经进一步研究比对，目前证实应为比伦按蚊(马颖等，2009；Rueda, 2005)。

2.2.4须喙按蚊: 须喙按蚊的序列目前已注册112条，样本来自印度尼西亚和泰国。来自印度尼西亚的须喙按蚊样本描述分为5支(clade)，其中第Ⅳ与Ⅴ支，Ⅱ与Ⅲ支间的样本序列几乎无差异，而两者间的差异性约为18%，第Ⅰ支与其的差异性约为23%和18%(Paredes-Esquiveletal., 2009)；来自泰国的样本描述分为4个型(Form A/B/C/D)，依据染色体核型确定，而ITS2序列间的差异性可达40%，其间差异程度与染色体核型未发现对应关系(Saeungetal., 2007, 2008；Suwannamitetal., 2009)。迄今，来自中国的须喙按蚊样本ITS2序列尚未注册，故应谨慎使用GenBank中的须喙按蚊ITS2序列。

2.2.5米赛按蚊: 米赛按蚊的序列目前已经注册有143条，样本分别来自俄罗斯、英国、瑞典和中国等14个国家，比对所有的序列，其间差异性小于1%，差异最大的样本均来自俄罗斯(AM409762-AM409776，AM409782-AM409799)和伊朗(AY050639)，注册者为Bezzhonova和Djadid等。

2.2.6其他蚊种: 萨氏按蚊已注册序列132条，样本来自8个国家，其间差异性小于1%，中国的样本尚无序列注册。赫坎按蚊已注册序列44条，样本来自4个国家，其中1条序列(EF613293)与其他的序列差异性为1.3%(Djadidetal., 2009)，其余的序列间差异均小于1.0%。

另外，在整理已注册按蚊亚属蚊种的ITS2序列时，发现在中国分布的有4个序列类型未订其学名，比对其序列，显示与各类型相似度最高蚊种分别如下：YM-2003a与雷氏按蚊(84%)、 LL1与凉山按蚊(80%)、LL2与An.hyrcanusgroupAn. sp.3.CPE-2010(100%)、LL3与比伦按蚊(93%)。另外，韩国学者还注册了中华按蚊与克莱按蚊杂交种的ITS2序列2条，分别与中华按蚊、克莱按蚊的相似性为100%(Joshietal., 2009)，笔者的实验室也曾检测到我国辽宁省野外存在的中华按蚊与克莱按蚊杂交种样本。

除上述和仅注册1条序列的蚊种外，其余的已注册的ITS2序列的按蚊亚属种内差异性均小于0.5%。

2.3 ITS2序列在种间的差异

笔者选取在GenBank中注册的中国按蚊亚属种类的其中1条序列作为蚊种的代表，进行种间序列差异分析，结果显示差异范围为1.2%～69.5%(表2)，其中种间差异性小于3%的仅为昆明按蚊与凉山按蚊、八代按蚊与筠连按蚊,其余种间的差异性均大于5%。

表2基于GenBank数据库中的中国按蚊亚属部分种类种间rDNA-ITS2序列差异性

Tab.2 Interspecific variation of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes,according to GenBank database

1:An.lesteri_AJ004941; 2:An. sp YM-2003a_AY306128; 3:An.belenrae_AY187728; 4:An. sp. LL3_JX944705; 5:An.kleini_FJ875072; 6:An.sinensis_AJ004942; 7:An.kunmingensis_AY170920; 8:An.liangshanensis_AY170922; 9:An.kweiyangensis_AF261150; 10:An.sineroides_GU384723; 11:An. sp. LL1_JX944687; 12:An.junlianensis_AY316155; 13:An.yatsushiroensis_AY186792; 14:An.hyrcanus_AF261149; 15.An.crawfordi_AF261949; 16:An.peditaeniatus_AY129958; 17:An. sp. LL2_JX944704; 18:An.messeae_AF305556; 19:An.sacharovi_AY238405; 20:An.lindesayi_JX944708; 21:An.koreicus_AY523635; 22:An.barbirostris_AB435969.

3 讨论

核糖体DNA是一个多拷贝基因家族，在细胞的多个转录单元中为一个或多个串联阵列，阵列可位于相同或不同染色体上，每个rDNA的转录单元在蚊虫中由3个基因、1个外转录间隔区和2个内转录间隔区组成，外部转录间隔区互相连接rDNA。rDNA是遗传信息的宝贵来源，功能区产生的核糖体高度保守，转录间隔区序列又具有较高的种间和种内变异。诸多的研究，以及本文的分析显示rDNA-ITS2序列的差异性在按蚊中具有良好的种内保守性和种间解析度(Dixitetal., 2010)，但因序列间长度差异大，比对困难，故不适合更高阶元的系统发育分析。

笔者在整理GenBank数据库中已注册的中国按蚊亚属蚊种的ITS2序列时，发现仍有近1/3的、分布局限和无医学重要性的种尚无序列注册；在已注册的序列中，由采自中国的样本测定的序列数量也较少。提示中国学者应加强研究，将测定的序列及时提交，一方面可供科学家们共享信息，另一方面可更准确和客观地评价ITS2分子标志的价值。

通过分析已注册的ITS2序列，提示其在中国按蚊亚属蚊种间具有良好的解析度，但也发现在部分种内存在一定程度的变异性(通常小于1%)。种内差异性存在的原因应是该种的进化快速且活跃，近期或正在隐种分化，如：中华按蚊种内差异性小于1%，已发现的野外中华按蚊与克莱按蚊的杂交种的事实，即是克莱按蚊从中华按蚊正在分化的印证和足迹。

笔者整理和分析GenBank数据库中的序列时，发现因注册者不同导致的种内序列差异屡见不鲜，有时难以判断其可靠性，故笔者以为出现上述情形时，应综合其他信息判断，如样本来源、鉴定者、注册者和序列是否发表等。